한국생명공학연구원 윤성호 박사

석유자원의 고갈과 환경문제의 대두는 합성유기화학 (synthetic organic chemistry) 기반의 화학산업으로부터 생산되어 오던 석유화학제품을 보다 환경친화적이고 자원 재사용이 가능한 바이오리파이너리 (bio-refinery)에 대한 관심을 불러일으키고 있다. 전통적으로 생물공학에서는 다양한 미생물을 세포공장 (cell factory)로 이용하여 유용 화학물질을 생산하여 왔다. 하지만 미생물 대사는 대부분의 유용화학물질을 대량생산할 수 있도록 진화되어 있지 않기 때문에, 거의 모든 경우의 유용물질 생산 연구에서는 이용 미생물의 대사 과정을 생산목적에 맞게 최적화시켜야 한다.
합성생물학(synthetic biology)은 모듈화되고 표준화된 생물부품 (biological part)을 조합하여 새로운 생물장치 (biological device)를 만들려고 한다. 대사공학은 일련의 대사경로(metabolic pathway)를 최적화하여 생물학적 파이프 (biological pipe)를 구축함으로써 원하는 생산물을 최대한 만들려고 한다 (그림 1). 부품 대 파이프, 장치 대 생산물, 일견 다른 듯 하면서 비슷하기도 한 합성생물학과 대사공학의 연구방법 및 연구분야는 점점 서로의 장점과 기술을 채용하고 있다. 더욱이, DNA 시퀀싱 기술과 DNA 합성 기술의 비약적인 발전으로 다양한 생물부품을 값싸고 쉽게 제작할 수 있게 됨에 따라, 현재의 대사공학은 그 동안 생물학적으로 합성 불가능했던 물질 생산에도 도전하고 있으며, 생산 수율 (product yield) 향상 뿐 아니라, 여러 배양 조건에서 대사 및 조절 작용을 제어(control)하려 하고 있다.
대사공학연구에서의 주요 목표 중 하나는 생산균주의 대사경로 최적화를 통한 생산수율(product yield)의 극대화이다. 자연적인 대사경로는 전사인자(transcription factor), 프로모터와 같은 수많은 조절 시스템(regulatory system)에 의해 제어되고 있기 때문에 대사경로 최적화를 위해서는 전사, 번역, 대사회로의 동역학(kinetics)의 정량적인 이해가 요구된다. 즉, 최종적으로 원하는 생산물로의 대사흐름 (metabolic flux)을 최대한으로 하기 위해서 미생물 내 조절 시스템을 변경하여야 한다. 대부분의 대사공학 연구에서는 특정 대사효소의 발현량을 증가시키거나, 원하는 대사경로와 경쟁하는 경로를 제거하기 위해 관련 유전자를 절단(gene knockout)하는 방법을 이용하여 왔다. 하지만, 많은 경우 이러한 시도는 필수적인 대사물질을 감소시키거나 독성 대사산물을 생성시켜 세포성장을 저해함으로써, 전체적으로 보면 오히려 생산수율을 감소시킬 수 있다. 근본적으로 대사경로 최적화는 다변수 최적화 문제로서 목적 생산물에 이르는 단 하나의 대사흐름 조절 단계 (rate controlling step)만이 존재하는 것이 아니기 때문이다. 궁극적인 대사공학 접근방법이란 전체 대사경로의 정량적인 이해를 통해 컴퓨터로 대사 및 조절 경로를 디자인하고, 여러 합성생물학 툴을 이용하여 관련된 여러 대사효소들의 발현량을 조절함으로써 세포공장을 구현하는 것이다. 본 기고에서는 대사경로 재설계를 통한 유용 화학물질 생산 전략에 대해 알아보고자 한다.

그림 1. 대사경로 최적화를 위한 부품과 파이프 (A) 합성생물학에서는 대사흐름을 제어하기 위하여 전사요소(transcription machinery), 대사효소 유전자의 프로모터, ribosome binding site(RBS), 번역 요소 (translation machinery)를 정밀 조절할 수 있는 부품을 개발한다. (B) 대사공학에서는 이러한 합성생물학 부품을 이용하여 최종생산물질로의 대사흐름을 최대화할 수 있도록 파이프를 구성한다. 일반적으로 이러한 파이프에서는 중간 단계의 효소 발현량을 증가시키고, 중간 대사산물의 축적은 감소시킨다. [Image from (Boyle and Silver 2012)]

돌연변이법에 의한 생산균주 개발
대사공학 연구에서 원하는 특성을 갖는 균주를 개발하기 위하여 유전자 돌연변이(mutagenesis)에 많이 의존하여 왔다. 이는 합리적 설계 (rational design)에 대비되는 개념으로, 미생물 내 대사회로나 조절 기작에 대한 정보가 부족할 때, 유일하게 쓸 수 있는 방법이다. 돌연변이법에 의한 균주개발의 성공 여부는 생성될 수 있는 돌연변이 균주의 라이브러리 수와 더 중요하게는 대용량 선별방법 (high throughput screening)의 존재하느냐에 달려 있다. 예를 들어, 1000 개의 유전자 중 4개만 돌연변이를 도입한다 해도 1000C4, 약 4 X 1010 에 달하는 mutant가 생성될 수 있어야 한다.
최근에 합성생물학 연구에서 개발된 돌연변이 도입방법은 균주의 대사정보를 돌연변이 유도에 적용하여 원하는 특성을 가진 돌연변이 라이브러리를 만드는 데 중점을 두고 있다. Global Transcription Machinery Engineering (gTME) 은 전사개시에 관련된 유전자들에만 선택적으로 돌연변이를 도입함으로써 전체 유전자의 상대적인 전사속도를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, S. cerevisiae의 TATA-binding protein에 돌연변이를 주어 원 균주보다 20% 균체성장이 향상된 에탄올 내성 균주를 찾아 내었다 (Alper et al. 2006). 돌연변이를 도입할 유전자들을 어느 정도 알고 있다면, 다층 자동화 유전 설계 (Multiplex Automated Genome Engineering (MAGE)) 방법으로 동시에 유전체 내 여러 군데에 mutation을 도입할 수 있다 (그림 2). 대장균에서 lycopene 생산균주를 개발하기 위하여, MEP 경로 내의 모든 유전자들의 RBS 염기서열을 조합적으로 변형시킴으로써 단시간 내에 lycopene을 대량으로 생산할 수 있는 균주를 개발할 수 있었다 (Wang et al. 2009).
이러한 조합적 돌연변이 방법은 원하는 특성을 가진 균주를 개발하는 데 유용한 방법임에는 틀림이 없지만, 대용량 선별방법이 존재하지 않을 경우 사용에 제한이 있다. 즉, 에탄올 내성 균주는 에탄올이 포함된 배지에서 빠른 성장을 보이거나, lycopene 생산 균주는 색깔 변화로 대용량으로 선별할 수 있다. 하지만, 대부분의 대사과정에 관련된 유전자들에 변형이 오면, 균체 성장이 저해 되거나, 생산물이 과량 축적되었음을 판별할 수 있는 기준이 모호할 때는 조합적 돌연변이 방법은 이용되기 어렵다. 또한, 원하는 생산물이 많이 생산하는 균주를 찾았다 해도 균체 성장이 저해되는 경우가 많아 여러 번의 실험을 반복하여야 하며, 균체 성장과 생산능이 모두 우수한 균주를 찾기란 매우 어렵다는 단점이 있다.

그림 2. Multiplex Automated Genome Engineering(MAGE). [Image from (Boyle and Silver 2012)

대사회로의 모듈화를 통한 대사회로 최적화
대사 네트워크를 일련의 개별적인 모듈(module)로 구조화함으로써 복잡한 조절작용을 피하고, 관련 효소의 발현량을 보다 쉽게 조절할 수 있다. 예를 들어, 다변수 모듈화 대사공학 (Multivariate modular metabolic engineering , MMME)을 이용하여, 일련의 대사과정에 속한 효소 유전자들을 비슷한 전환속도 (turnover)를 갖는 유전자들끼리 그룹핑하고, 각 그룹별로 발현량을 조절함으로써, 원하는 대사흐름을 보다 쉽게 최적화시킬 수 있다. 그 대표적인 예로 대장균에서의 taxane 생산 연구를 들 수 있는데 (Ajikumar et al. 2010), 2-methyl-(D)-erythritol-4-phosphate (MEP) pathway에 관련된 유전자들을 두 개의 오페론으로 모듈화하고, 각 오페론의 발현량을 프로모터 세기와 플라스미드 복제수 (copy number)로 조절함으로써, 기존 taxane 생산량을 15,000 배 높일 수 있는 최적의 대사회로를 구축할 수 있었다 (그림 3).

그림 3. 다변수 모듈화 기법 (Multivariate modular metabolic engineering , MMME)을 이용한 taxadien 생산의 최적화 (a) glucose에서 taxadiene에 이르는 MEP 경로를 upstream module (G3P와 pyruvate부터 DMAPP와 IPP까지)와 downstream module (DMAPP와 IPP 부터 Taxadiene)의 두개로 모듈화하고, 관련 유전자를 오페론으로 구조화함. (b) 각 오페론의 발현을 프로모터 세기와 플라스미드 복제 수로 조합하여 최적의 taxadiene 생산량을 얻음. [Image from (Yadav et al. 2012)]

대사경로의 모듈화를 통한 유용물질 생산의 또 다른 예로는 대장균에서의 말라리아 치료제 전구체인 amorphadiene생산을 들 수 있다 (Pitera et al. 2007). 초기 대사물질인 mevalonate와 farnesyl pyrophosphate (FPP)를 합성하기 위해 효모 (Saccharomyces cerevisiae)와 대장균 유래의 유전자들을 두 개의 오페론 (operon, 하나의 promoter에 의해 하나의 mRNA로 전사되는 일련의 인접한 유전자들)으로 구성하였다 (그림 4). FPP는 Artemisia 유래의 amorphadiene synthase (ads)와 cytochrome P450 monooxygenase (p450)에 의해 artemisinic acid로 전환되고, 이는 기존의 화학반응공정으로 artemisinin으로 전환될 수 있다. 중간 대사산물들의 과량 축적으로 인한 균체성장 저하, 외래 유전자의 발현 감소, 일련의 유전자들의 불균형한 발현 등을 막기 위해 외래 유전자들의 codon최적화, 오페론 유전자들 사이의 염기서열 (intergenic region)을 변형, 세포 내 산화환원력 (redox potential)의 균형, transcriptome 분석을 통한 세포 내 stress원인 규명, 도입된 plasmid의 안정성 향상 (segregational stability)등의 다양한 노력들이 최근까지 이루어지고 있다.