¿ÞÂÊ ¸Þ´º ŸÀÌƲ À̹ÌÁö
¿¬±¸µ¿Çâ

Home < ¿­¸°¸¶´ç < ¿¬±¸µ¿Çâ

       ÇÕ¼ºÀ¯ÀüÀÚÀÇ ¹ßÇöÀ» À§ÇÑ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖÀÇ genome engineering
       jhroe@snu.ac.kr        
       ³ëÁ¤Çý        2013.09.24 11:01        16104
´Ù¿î·Îµå : ÇÕ¼ºÀ¯ÀüÀÚÀÇ ¹ßÇöÀ» À§ÇÑ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖÀÇ genome engineering(¼­¿ï´ë ÀÌ°­·Ï, ³ëÁ¤Çý).pdf(316 Kb)
 

ÇÕ¼ºÀ¯ÀüÀÚÀÇ ¹ßÇöÀ» À§ÇÑ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖÀÇ genome engineering

 

                                                                                                ÀÌ°­·Ï, ³ëÁ¤Çý

                                                                                       ¼­¿ï´ëÇб³ »ý¸í°úÇкÎ

      

 

1. °³¿ä

 

ÇÕ¼º»ý¹°ÇÐÀº ´ëºÎºÐÀÇ °æ¿ì »õ·Î¿î ¹°ÁúÀ» ÇÕ¼ºÇϰųª ƯÁ¤ ¹°ÁúÀ» ºÐÇØÇϵµ·Ï ¼³°èµÈ »ý¸íü¸¦ ¸¸µé¾î³»´Â °ÍÀ» ¸ñÀûÀ¸·Î ÇÑ´Ù. À̸¦ À§Çؼ­´Â ±âÁ¸¿¡ Á¸ÀçÇÏÁö ¾Ê´ø »õ·Î¿î À¯Àü ÇüÁúÀ» »ý¸íü ³»·Î µµÀÔÇÏ´Â °ÍÀÌ ÇÊ¿äÇÏ´Ù. À̸¦ À§ÇØ Çö󽺹̵忡 ¿øÇÏ´Â À¯ÀüÀÚµéÀ» µµÀÔÇؼ­ ¹ßÇö½ÃÅ°´Â ¹æ¹ýÀÌ ÀÖÁö¸¸, ±âÁ¸¿¡ Á¸ÀçÇÏ´Â À¯ÀüÀÚµéÀÇ »ê¹°°úÀÇ »óÈ£ÀÛ¿ëÀ¸·Î ÀÎÇؼ­ µ¶¼ºÀ» ³ªÅ¸³»´Â µîÀÇ ºÎÀÛ¿ëÀÌ ¹ß»ýÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù. ÀÌ·¯ÇÑ ¹®Á¦ ÇØ°áÇϱâ À§ÇØ ´ëÀå±Õ¿¡¼­ À¯Àüü ³»¿¡ Á¸ÀçÇÏ´Â À¯ÀüÀÚ¿¡ µ¹¿¬º¯À̸¦ ÀÏÀ¸Å°°í, À̸¦ ´ë½ÅÇÒ ¼ö ÀÖ´Â ´Ù¸¥ À¯ÀüÀÚ¸¦ µµÀÔÇÏ´Â ¹æ¹ýµéÀÌ °³¹ßµÇ°í ÀÖ´Ù.


À¯Àüü·ÎÀÇ À¯ÀüÀÚ µµÀÔ ¹æ¹ýÀº ´ëÀå±Õ»Ó¸¸ ¾Æ´Ï¶ó, High GC ±×¶÷ ¾ç¼ºÀÎ Streptomyces¿¡¼­µµ Àû±ØÀûÀ¸·Î È°¿ëµÇ°í ÀÖ´Ù. Streptomyces´Â ¹Ì»ý¹°·ÎºÎÅÍ ¸¸µé¾îÁö´Â Ç×»ýÁ¦¿Í À¯¿ëÇÑ ÀÌÂ÷´ë»ç»ê¹° Áß ¾à Àý¹ÝÀ» ¸¸µé¾î ³»°í ÀÖ´Ù. ±×·¯³ª ½ÇÁ¦ ¹ß°ßµÇ´Â Streptomyce Áß ¸¹Àº °æ¿ì ¹è¾çÇϱ⠺ÎÀûÇÕÇؼ­ ¾ÆÁ÷ ´Ù¾çÇÑ Á¾ÀÇ Streptomyces°¡ ¿¬±¸µÇÁö ¸øÇÏ°í ÀÖ´Ù. °Ô´Ù°¡ Ç×»ýÁ¦ ³»¼º±ÕÀÇ Áõ°¡·Î ÀÎÇØ ÀÌ·¯ÇÑ ¹è¾çÇϱâ Èûµç ±ÕÁÖµéÀÌ °¡Áø ¸¹Àº Ç×»ýÀ̳ª Ç×±Õ¿¡ °ü¿©ÇÏ´Â ¹°ÁúÀÇ Á߿伺ÀÌ Ä¿Áö°í ÀÖ´Ù. ÀÌ·¯ÇÑ À¯ÀüüµéÀ» µµÀÔÇؼ­ ¹ßÇö½Ãų ±ÕÁÖ·Î ºñ½ÁÇÑ À¯ÀüÁ¤º¸¸¦ °¡Áø ÀÌÁ¾¼÷ÁÖ StreptomycesµéÀÌ ÀÌ¿ëµÇ°í ÀÖ´Ù. ¶ÇÇÑ BacteriaÀÇ È¿°úÀûÀÎ genome editingÀ» À§ÇØ RNA¸¦ È°¿ëÇÑ editing systemµµ Á¡Â÷ ¸¹ÀÌ È°¿ëµÇ°í ÀÖ´Ù.

 

2. ´ëÀå±ÕÀÇ recombineering

 

ƯÁ¤ À§Ä¡¿¡¼­ »óÀÌÇÑ À¯ÀüÀÚ¸¦ ¹ßÇöÇÏ´Â µ¹¿¬º¯À̸¦ ¸¸µé±â À§Çؼ­, phage-based homologous recombinationÀ» ÀÌ¿ëÇÏ´Â °ÍÀ» RecombineeringÀ̶ó°í ÇÑ´Ù. ´ëÇ¥ÀûÀ¸·Î ´ëÀå±Õ¿¡¼­ linear DNA¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ °£ÆíÇÑ µ¹¿¬º¯ÀÌ Á¦Á¶¸¦ À§Çؼ­ ¥ë phage DNA¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ site-directed recombination ¹æ¹ýÀÌ ÀÖ´Ù. Red systemÀ̶ó°í ÇÏ´Â 5¡¯¡æ3¡¯ exonuclease, recombinase¿Í RecBCDÀÇ inhibitorÀÌ È°¼ºÈ­µÈ ±ÕÁÖ¿¡, homologous region°ú maker À¯ÀüÀÚ¸¦ °¡Áø linear DNA¸¦ transformationÇÏ´Â ¹æ¹ýÀ» ÅëÇؼ­ µ¹¿¬º¯À̸¦ Á¦Á¶ÇÏ°Ô µÈ´Ù. »õ·Î¿î ÇüÁú µµÀÔ °úÁ¤¿¡¼­ markerµéÀº ¸ðµÎ Á¦°ÅµÇ´Âµ¥, markerÀÇ Á¾·ù¿¡ µû¶ó ´Ù¾çÇÑ Á¦°Å ¹æ¹ýÀÌ Á¸ÀçÇÑ´Ù. Flp-FRT, Cre-lox system ȤÀº I-SceI´Â markerÀÇ Á¾·ù¿Í »ó°ü¾øÀÌ site-specific recombinationÀ» ÀÌ¿ëÇؼ­ ¿øÇÏÁö ¾Ê´Â DNA¸¦ À߶󳻴 ¹æ¹ýÀ¸·Î À¯Àüü¿¡ scar¶ó°í ÇÏ´Â DNA sequence¸¦ ³²±â°Ô µÈ´Ù. scar¸¦ ¸¸µéÁö ¾Ê±â À§Çؼ­ »ç¿ëµÇ´Â counter-selectionÀº homologous recombinationÀ» ÀÌ¿ëÇؼ­, marker·Î »ç¿ëµÈ sacB, tetAR, rpsL, ȤÀº galK°¡ µµÀÔÇÏ°íÀÚ ÇÏ´Â À¯ÀüÀÚ·Î ´ëüµÈ °ÍÀ» °ñ¶ó³»´Â ¹æ¹ýÀÌ´Ù.


 

±×¸² 1. ´ëÀå±Õ À¯Àüü »ó¿¡ À¯ÀüÀÚµéÀ» directed integrationÇÏ´Â ¹æ¹ýµé. »óµ¿ Áö¿ªÀº Àû»ö (A), ³ì»ö (B), ³ë¶õ»ö (C) »óÀÚ·Î

          Ç¥½ÃµÈ´Ù. DTG, »èÁ¦ ´ë»ó À¯ÀüÀÚ, res, Ç×»ýÁ¦ ÀúÇ×¼º À¯ÀüÀÚ, GOI, ±× À¯ÀüÀÚ FLP¿Í SceI ÀÎ½Ä »çÀÌÆ®µéµµ Ç¥½ÃµÈ´Ù.

          (Richter and Gescher, 2012)

 


RecombineeringÀÌ ¿øÇÏ´Â À§Ä¡¿¡ À¯ÀüÀÚ¸¦ µµÀÔÇÒ ¼ö À־ ´ëºÎºÐ »ç¿ëÇÏ´Â ¹æ¹ýÀÓ¿¡µµ ºÒ±¸ÇÏ°í, Phage- and transposon-based site-specific integration systems´Â ¸¹Àº ÀåÁ¡À¸·Î ÀÎÇؼ­ ¿©ÀüÈ÷ À¯¿ëÇÏ°Ô ÀÌ¿ëµÇ°í ÀÖ´Ù. ±× ÀåÁ¡µé·Î´Â À¯Àüü¿¡ integration È¿À²ÀÌ ¸Å¿ì ³ô°í, ƯÁ¤ À§Ä¡¿¡¸¸ ÀϾ±â¿¡ ¿¹ÃøÀÌ °¡´ÉÇϸç, integrationÀÌ ÀϾ´õ¶óµµ °¡¿ªÀûÀ̶ó´Â °Í µîÀÌ ÀÖ´Ù. CRIM (conditional-replication, integration and modular) plasmids´Â ´Ù¼¸°¡ÁöÀÇ ´Ù¸¥ attP site¿Í ¼­·Î ´Ù¸¥ Ç×»ýÁ¦ ÀúÇ×¼ºÀ» ÀÌ¿ëÇؼ­ ¸ðµÎ¸¦ »ç¿ëÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù. ¶Ç´Ù¸¥ ¹æ¹ýÀ¸·Î Tn7ÀÌ ¸Å¿ì ³ôÀº È¿À²·Î glmS geneÀÇ 3¡¯ end¿¡ ³¢¾î µé¾î°¡´Â ¿ø¸®¸¦ ÀÌ¿ëÇؼ­ marker¸¦ ÀÌ¿ëÇÏÁö ¾Ê°í ÇüÁúÀ» µµÀÔÇϱ⵵ ÇÑ´Ù.


µµÀÔµÈ À¯ÀüÀÚµéÀÇ ¹ßÇöÀ» À§Çؼ­´Â, ¹ßÇöÀ» ÅëÇØ ³ªÅ¸³¯ ¼ö ÀÖ´Â ÀáÀçÀû µ¶¼ºÀ» ¹æÁöÇϰųª ÇÕ¼º°úÁ¤ÀÇ ´Ù¾çÇÑ ´Ü¹éÁú È°¼ºÀ» Á¶ÀýÇÏ´Â °ÍÀÌ ¸Å¿ì Áß¿äÇÏ´Ù. ¹ßÇö·®ÀÇ Á¶Àý¿¡¼­ promoterÀÇ ¼±ÅÃÀº ÅëÁ¦°¡´ÉÇÑ Àü»ç Á¶ÀýÀ» À§Çؼ­ ÇʼöÀûÀÌ´Ù. À̸¦ À§Çؼ­ lac, ara and tet promoters¿Í º¯Çüüµé ¿Ü¿¡µµ propionate promoter, alkS¿Í alkB promoter, ugp promoter, tac promoter, rhaPBAD promoter µîÀÌ »ç¿ëµÇ°í ÀÖ´Ù.

 

3. Streptomyces¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ ÀÌÂ÷´ë»ç»ê¹° ÇÕ¼º À¯ÀüÀÚÀÇ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖ ¹ßÇö

Streptomyces´Â 1) ÀÌÂ÷ ´ë»ç»ê¹° »ýÇÕ¼º À¯ÀüÀÚÀÇ clustering È®ÀÎ, 2) õ¿¬¹°ÀÇ ºÐ¼®, 3) À¯ÀüÀÚ engineeringÀ» ÅëÇÑ Ãµ¿¬¹°ÀÇ º¯ÀÌü »ý»ê, 4) À¯ÀüÀÚ library screeningÀ» ÅëÇÑ »õ·Î¿î È­ÇÕ¹°ÀÇ ¹ß°ß¿¡ ÀÌ¿ëµÇ¾î ¿Ô´Ù. ±¸Ã¼ÀûÀÎ ¿¹·Î, ÀϺ» Kitasato ´ëÇÐÀÇ Ikeda ±³¼ö ¿¬±¸ÁøÀº avermectin (Polyketide °è¿­ÀÇ Ç× ±â»ýÃæÁ¦)ÀÇ »ý»ê ±ÕÁÖÀÎ Streptomyces avermitilisÀÇ genome minimize¸¦ ÅëÇØ ´Ù¾çÇÑ ÀÌÂ÷´ë»ç»ê¹°ÀÇ »ý»êÀÌ °¡´ÉÇÑ ¹æ¼±±Õ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖ¸¦ °³¹ßÇÏ¿´´Ù. ÇØ´ç ¿¬±¸ÁøÀº Spectinomycin, chephamycin, pladienolide, sesquiterpene µî ´Ù¾çÇÑ ÀÌÂ÷´ë»ç»ê¹°ÀÇ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖ »ý»ê¿¡ ¼º°øÇÏ¿© ¹æ¼±±Õ ¼¼Æ÷°øÀåÀÇ °³¹ß °¡´É¼ºÀ» º¸¿©ÁÖ¾ú´Ù. John Innes CentreÀÇ Mervyn J. Bibb ±³¼ö ¿¬±¸ÁøÀº ÀÌÂ÷´ë»ç»ê¹°ÀÇ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖ¹ßÇöÀ» ÃÖ´ëÈ­ ÇÏ°í, ÃÖÁ¾»ê¹°ÀÇ ¼ø¼öºÐ¸®°úÁ¤À» ´Ü¼øÈ­±â À§ÇÏ¿©, ±âÁ¸ÀÇ 2Â÷´ë»ç gene clusterµéÀ» Â÷·Ê·Î deletion½ÃŲ S. coelicolor±ÕÁÖ¸¦ °³¹ßÇÏ¿´´Ù. Gene clusterÀÇ deletionÀ» À§Çؼ­´Â clusterÀÇ 5¡¯ side¿Í 3¡¯ side¿¡¼­ °¢°¢ 2 kbÁ¤µµÀÇ À¯ÀüÀÚÁ¶°¢À» ÇÕ¼ºÇÏ°í ÀÌ°ÍÀ» ligationÇÑ recombinant DNA¸¦ suicide vector¸¦ ÀÌ¿ëÇÏ¿© ¼÷ÁÖ¿¡ µµÀÔÇÑÈÄ double cross-over°¡ ÀϾ ±ÕÁÖ¸¦ ã´Â ¹æ½ÄÀ¸·Î ÁøÇàÇÑ´Ù. ¿©±â¿¡ Àü»ç¿Í ¹ø¿ªÀÇ Æ¯À̼ºÀ» º¯È­½ÃŲ RNA ÁßÇÕÈ¿¼Ò rpoB¿Í ribosome´Ü¹éÁú rpsLÀÇ point mutationÀ» ÷°¡ÇÏ¿© heterologous gene cluster·ÎºÎÅÍ ÀÌÂ÷´ë»ç»ê¹°ÀÇ »ý»ê¼ºÀ» Å©°Ô Áõ°¡½Ãų ¼ö ÀÖ´Â ¹æ½ÄÀÌ ¼º°øÇÒ ¼ö ÀÖÀ½À» º¸¿©ÁÖ¾ú´Ù. ±ä±æÀÌÀÇ »ýÇÕ¼º À¯ÀüÀÚ cluster¸¦ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖ¿¡ ¾ÈÁ¤ÀûÀ¸·Î µµÀÔÇÏ´Â artificial chromosome vectorµéÀº ´ëÀå±ÕÀÇ F factor³ª P1 phage¿¡ ±â¹ÝÇÑ BAC°ú PACÀ¸·ÎºÎÅÍ °³¹ßµÇ¾î 100 kbÀÌ»óÀÇ DNA¸¦ µµÀÔÇÏ´Â ½Ã½ºÅÛµéÀÌ ¾²ÀÌ°í ÀÖ´Ù (Alduina and Gallo, 2012).

 

4. CRISPR/Cas systemÀÇ È°¿ë


ÃÖ±Ù¿¡´Â CRISPR(clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats)°ú ¿¬°èµÈ Cas9 endonuclease¸¦ È°¿ëÇÑ genome editing¹æ¹ýÀÌ ¸¹ÀÌ »ç¿ëµÇ°í ÀÖ´Ù. ´ëÀå±Õ°ú Streptococcus¸¦ ´ë»óÀ¸·Î ÇÑ ½ÇÇè¿¡¼­, µÎ°³ÀÇ short CRISPR RNA (crRNA)¸¦ »ç¿ëÇÑ multiplex mutagenesis°¡ °¡´ÉÇÏ°í, mutation µÇÁö ¾ÊÀº genomeÀº dual-RNA-Cas complex¸¦ ÀÌ¿ëÇÏ¿© À߶ó³¿À¸·Î½á selectable marker³ª counter-selectionÀ» ¿ìȸÇØ°¡´Â ¹æ¹ýÀÌ °³¹ßµÇ¾ú´Ù. Rockefeller ´ëÇÐ Marraffini groupÀÇ º¸°í¿¡ µû¸£¸é, S. pnemoniae´Â °ñ¶ó³½ ±ÕÁÖÀÇ 100%°¡ ¸ðµÎ mutant¿´°í, E. coli´Â 65%¿¡ ÇØ´çÇÑ´Ù°í ÇÑ´Ù. ÀÌ ¹æ¹ýÀÇ Àû¿ëÀÌ ´Ù¸¥ ±ÕÁÖµéÀÇ genome editing¿¡µµ À¯¿ëÇÏ°Ô »ç¿ëµÉ °ÍÀ¸·Î Àü¸ÁµÈ´Ù. Genome editing »Ó¾Æ´Ï¶ó engineered CRISPR/Cas systemÀ» ÀÌ¿ëÇÏ¿© À¯ÀüÀÚÀÇ ¹ßÇöÀ» ¾ïÁ¦Çϰųª È°¼ºÈ­½ÃÅ°´Â Àü·«µµ »ç¿ëµÉ ¼ö ÀÖ´Ù.


±×¸² 2. CRIPR-Cas ½Ã½ºÅÛÀ» ÀÌ¿ëÇÑ genome editingÀÇ °³³ä. Chromosome»óÀÇ target À¯ÀüÀÚ¿¡ ´ëÇÑ Dual-RNA:Cas9ÀÇ

           nucleaseÈ°¼ºÀ» ÀÌ¿ë. ¿øÇÏ´Â ÇüÅ·ΠeditingÀÌ µÈ template·Î ġȯµÈ targetÀº À߸®Áö ¾Ê°í, ġȯµÇÁö ¾ÊÀº ¿ø·¡

           À¯ÀüÀÚ´Â À߸²À¸·Î½á, edited genomeÀ» ¾òÀ» È®·üÀ» ±Ø´ëÈ­ ÇÒ ¼ö ÀÖÀ½. (Jiang et al., 2013)

 

5. Âü°í¹®Çå

 

- Richter, K. and Gescher, J., (2012) The molecular toolbox for chromosomal heterologous multiprotein expression in Escherichia coli. Biochem. Soc. Trans. 40:1222-1226.
-Komatsu M, Uchiyama T, Omura S, Cane DE, Ikeda H. (2010) Genome-minimized Streptomyces host for the heterologous expression of secondary metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 9;107(6):2646-51.
-Gomez-Escribano, J.P., Bibb, M.J. (2011) Engineering Streptomyces coelicolor for heterologous expression of secondary metabolite gene clusters. Microb Biotechnol. 4(2):207-15
-Gomez-Escribano, J.P., Bibb, M.J. (2012) Streptomyces coelicolor as an expression host for heterologous gene clusters. Methods Enzymol. 517:279-300
-Alduina, R. and Gallo, G. (2012) Artificial chromosomes to explore and to exploit biosynthetic capabilities of actinomycetes. J Biomed Biotechnol. 2012:462049
-Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., Zhang, F. (2013) Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339:819
-Bikard, D., Jiang, W., Samai, P., Hochschild, A., Zhang, F., Marraffini, L.A. (2013) Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 41(15):7429-7437
-Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L.A. (2013) RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol. 31(3):233-9.




Total:118 page:(8/7)
22 Á¤º¸ ÀÌÁ¤°É ÇÕ¼º»ý¹°ÇÐ ºÎÇ° °³·®À» À§ÇÑ ´Ü¹éÁú°øÇÐÀÇ ¿¬±¸.. 14.03.04 21834
21 Á¤º¸ ÀÌÁö¿¬ Light signaling proteinÀÇ ±â´É ¹× ¹ÙÀÌ¿À ºÎÇ°.. 14.03.04 10773
20 Á¤º¸ ÀÌ¿µÈÆ ´ëÀå±Õ ncRNAÀÇ ÇÕ¼º »ý¹°ÇÐ ¹× ÀÌÀÇ ÀÀ¿ë 13.11.06 14250
19 Á¤º¸ À̼º±¹ Genome engineeringÀ» ÅëÇÑ Áö´ÉÇü Àΰø¹Ì»ý¹° °³.. 13.11.05 19490
18 Á¤º¸ ÀÌ»ó¿± ¹Ì»ý¹°¿¡¼­ÀÇ ÇÕ¼º»ý¹°ÇÐÀû ±â¹ýÀ» ÀÌ¿ëÇÑ À¯ÀüÀÚ.. 13.10.24 15822
17 Á¤º¸ À̱չΠCHO ¼¼Æ÷¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ ½Ã½ºÅÛ »ý¹°ÇÐ ¹× ÇÕ¼º »ý¹°ÇÐ.. 13.09.24 10532
16 Á¤º¸ ³ëÁ¤Çý ÇÕ¼ºÀ¯ÀüÀÚÀÇ ¹ßÇöÀ» À§ÇÑ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖÀÇ genome eng.. 13.09.24 16105
15 Á¤º¸ ISBC [Nature Biotechnology_News] Synthetic biology .. 13.09.11 7537
14 Á¤º¸ À±¿©ÁØ ¹æ¼±±Õ ÀÌÁ¾¼÷ÁÖ »ý»ê½Ã½ºÅÛÀÇ ¿¬±¸ µ¿Çâ 13.09.02 15115
13 Á¤º¸ ±è ÇÊ ¼¼Æ÷¿¡³ÊÁö Á¦¾î ¹ÙÀÌ¿À½Ã½ºÅÛÀÇ °³¹ß ¹× ¿ë¿ë(°¡.. 13.07.01 11429
12 Á¤º¸ ±èÁöÇö ½Ã½ºÅÛ»ý¹°ÇÐÀÇ ÇÕ¼º»ý¹°ÇÐ Àû¿ëÀ» À§ÇÑ Ç¥ÁØÈ­(.. 13.07.01 14271
11 Á¤º¸ ±è¼±¿ø Áö´ÉÇü ¼¼Æ÷´ë»çÁ¶Àý ½Ã½ºÅÛÀÇ ÃÖ±Ùµ¿Çâ(°æ»ó´ë .. 13.07.01 13267
10 Á¤º¸ ±èµ¿ÈÆ ¼¼Æ÷¸· Á¦¾î ±â¼úÀÇ Àû¿ëÀ» ÅëÇÑ Áö¹æ»ê »ý»ê(ÇÑ.. 13.05.20 18936
9 Á¤º¸ ±èµ¿¸í ÇÕ¼º »ý¹°Çп¡¼­ÀÇ ¹«¼¼Æ÷ ´Ü¹éÁú ÇÕ¼º ½Ã½ºÅÛÀÇ .. 13.05.06 20126
8 Á¤º¸ ±è±ÙÁß ¼¼Æ÷Á¦¾î Àΰø À¯Àüȸ·Î ¿¬±¸µ¿Çâ(Àü³²´ë ±è±ÙÁß .. 13.04.04 18471
7 Á¤º¸ ±Ç¿À¼® 2°³-ÀÎÀÚ ½ÅÈ£Àü´Þ°è¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ Àΰø½ÅÈ£Àü´Þ°è °³.. 13.03.18 14348
[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8]