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       친환경 방향족 폴리에스테르 생산 시스템 개발
               
       ISBC        2020.04.13 14:51        197
 

친환경 방향족 폴리에스테르 생산 시스템 개발


한국과학기술원 이상엽 교수


Yang JE, Park SJ, Kim WJ, Kim HJ, Kim BJ, Lee H, Shin J, & Lee SY (2018). One-step fermentative production of aromatic polyesters from glucose by metabolically engineered Escherichia coli strains. Nature Communications 2018 January DOI: 10.1038/s41467-017-02498-w


1. 연구배경


방향족 폴리에스테르는 강도 및 열안정성이 우수하여 병, 식료품 포장재 등에 다양하게 사용되고 있는 중요한 원료이다. 대표적인 방향족 폴리에스테르로는 PET(폴리에틸렌테레프탈레이트: PET병 원료)가 있다. 현재 방향족 폴리에스테르는 촉매 등을 사용하는 복잡한 공정을 통해 생산되기 때문에 비효율적일 뿐만 아니라 친환경적이지 못한 단점을 가지고 있었다. 따라서 환경에 부담을 주지 않는 지속가능한 친환경 생산 시스템의 개발이 필요로 하였다.


2. 연구내용


본 연구진은 비식용 바이오매스를 이용한 환경 친화적 방향족 폴리에스테르 생산 기술을 개발하기 위하여, 미생물 유래 고분자인 폴리하이드록시알카노에이트의 생합성 시스템을 기반으로, 고분자 생산에 핵심이 되는 코에이-전이효소 (CoA-transferase)의 기존에 밝혀지지 않은 신규 활성을 규명하고 이를 활용하여서 다양한 종류의 방향족 폴리에스테르를 생산하였다 (그림 1).


그림 1. 재조합 대장균을 통한 방향족 폴리에스테르 생산 전략 요약


□ 방향족 폴리에스테르 생산을 위한 시스템 수준의 대사회로 재설계


방향족 폴리에스테르를 생합성하기 위해 포도당으로부터 D-페닐락테이트를 생산하는 대장균 균주를 제작하였다. 방향족 화합물의 생합성은 3-데옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트-7-인산 (DAHP)의 합성에서 시작되며, DAHP는 DAHP 합성효소에 의한 포스포에놀피루베이트 (PEP)와 에리쓰로즈-4-인산 (E4P)의 축합으로 생성된다. 생성된 DAHP는 페닐피루베이트 (PPA)로 전환된 후, D-페닐락테이트 디하이드로게네이즈 (FldH)에 의해 D-페닐락테이트로 전환된다 (그림 2). 방향족 화합물 생합성을 위한 대사경로는 다양한 저해작용에 의해 복잡하게 제어되는 것으로 알려져 있다. aroG 유전자에 의해 코딩되는 DAHP 합성효소와 pheA 유전자에 의하여 코딩되는 코리스메이트 뮤타아제/프레페네이트 디하이드로게네이즈의 발현은 L-페닐알라닌에 의하여 저해된다. 본 연구에서는 L-페닐알라닌에 의한 피드백 저해를 해제하기 위해 피드백 저해 내성 돌연변이 AroGfbr [AroG (D146N)] 및 PheAfbr [PheA (T326P)]를 제작하였다. AroGfbr, PheAfbr 및 C. botulinum A str. ATCC 3502 유래의 FldH를 발현하는 재조합 대장균을 제작하였다. 또한, 이 과정에서 본 연구진은 외래 대사경로의 도입과 조작만으로는 방향족 폴리에스테르의 생산이 효율적이지 않았기 때문에 시스템 수준의 대사흐름 증대기술을 필요로 하였다. 이에 컴퓨터 기반 인실리코 시뮬레이션을 이용한 대장균 균주의 대사흐름분석 기법을 활용하여 시스템 수준의 대사회로 재설계를 진행하였다 (그림 2). 제작된 균주를 20 g/L 포도당 및 1 g/L의 sodium 3-hydroxybutyrate (소듐 3HB)를 함유하는 배지에서 배양하여 폴리(52.1 mol% 3HB-co-47.9 mol% D-페닐락테이트)를 건조 세포 무게의 15.8 중량% 함량으로 생산하는데 성공하였다. 또한, 유가식 발효 (fed-batch)를 통해 폴리(52.3mol% 3HB-co-47.7mol% D-페닐락테이트)를 건조 세포 무게의 24.3 중량% 함량으로 생산하였다.


그림 2. 방향족 폴리에스테르 생산을 위한 균주 조작 전략

□ 합성 프로모터 기반 플럭스 조절을 통한 다양한 몰분율의 방향족 단량체를 함유하는 폴리에스테르의 생합성


외부로부터 3HB를 첨가하지 않고도 방향족 폴리에스테르를 생산하는 균주를 제작하기 위하여, 방향족 폴리에스테르 생산균주에서 3-hydroxybutyryl-CoA 합성에 관여하는 R. eutropha β-ketothiolase (PhaA)와 acetoacetyl-CoA reductase (PhaB)를 추가로 발현시키고, 3HB 보충없이 포도당에서 방향족 폴리에스테르를 생산하고자 하였다. 그 결과, 폴리 (86.2 mol% 3HB-co-13.8 mol% D-페닐락테이트)를 건조세포 무게의 18.0 중량%로 포도당으로부터 생산할 수 있었다. 또한, 산업적 응용에 중요한 다양한 단량체 몰분율을 갖는 방향족 폴리에스테르의 생산을 합성 Anderson 프로모터(http://parts.igem.org/)를 사용한 PhaAB의 대사 플럭스 조절을 통해 시도하였다. 상이한 강도의 5 가지 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 균주를 제작하였다 (그림 3).

그림 3. 합성 프로모터 기반 플럭스 조절을 통한 다양한 몰분율의 D-페닐락테이트 함유 폴리에스테르의 생합성

그림 3. 합성 프로모터 기반 플럭스 조절을 통한 다양한 몰분율의 D-페닐락테이트 함유 폴리에스테르의 생합성


PhaAB 발현이 감소함에 따라 D-페닐락테이트 단량체 몰분율은 증가하였고,  각각 11.0 mol%, 15.8 mol%, 20.0 mol%, 70.8 mol% 및 84.5 mol%의 D-페닐락테이트를 함유하는 공중합체를 생산하였다 (아래 표). 이러한 결과는 대사 플럭스를 조절함으로써 다양한 몰분율의 방향족 단량체를 함유하는 방향족 폴리에스테르를 생합성 할 수 있음을 시사한다.


표. 다양한 몰분율의 D-페닐락테이트를 함유하는 폴리에스테르의 합성


□ 유가식 발효를 통한 방향족 폴리에스테르의 생합성


다음으로 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 방향족 폴리에스테르 생산균주의 pH-stat 배양을 3HB의 공급없이 수행하였다. 배양 96 시간 후 중합체 함량이 건조세포 무게의 43.8 중량%인 폴리 (67.6 mol% 3HB-co-32.4 mol % D-페닐락테이트)를 2.5 g/L로 생산하였다 (그림 4). 방향족 폴리에스테르의 생산을 더욱 향상시키기 위해 방향족 폴리에스테르 생산균주 염색체 내의 ldhA 유전자를 fldH 유전자로 대체하여 유전자 발현 시스템을 최적화했다. 또한, ldhA 유전자의 천연 프로모터를 강한 trc 프로모터로 대체하여 fldH 유전자의 발현을 증가시켰다. 나아가 유가식 발효공정을 최적화하여 13.9 g/L의 방향족 폴리에스테르를 생산하였다 (그림 4). 이를 통해 생화학 시스템을 사용하여 비천연 고분자인 방향족 폴리에스테르를 고효율로 생산하는데 최초로 성공하였다. 해당 시스템을 사용하면 배양액 1L당 13.9 g의 방향족 폴리에스테르의 생산이 가능하다. 또한, 해당 시스템을 통해 다양한 종류의 방향족 폴리에스테르의 생합성에도 성공함으로써, 이번 연구에서 개발된 환경친화적 생합성 시스템의 기술적 우수성을 증명하였다.


그림 4. 유가식 발효를 통한 방향족 폴리에스테르의 생산. AroGfbr, PheAfbr, FldH, PhaC1437 및 HadA를 발현하는 대장균 XB201TBAL의 유가식 발효를 통한 세포 성장 및 D-페닐락테이트 생산 (a) 및 고분자 함량 및 조성 (b), AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA, PhaC1437 및 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBAL의 유가식 발효를 통한 세포 성장 및 D-페닐락테이트 생산 (c) 및 고분자 함량 및 조성 (d), AroGfbr, PheAfbr, FldH, HadA, PhaC1437 및 BBa_J23114 프로모터 하에서 PhaAB를 발현하는 대장균 XB201TBALF의 유가식 발효를 통한 세포 성장 및 D-페닐락테이트 생산 (e) 및 고분자 함량 및 조성 (f)


3. 기대효과


본 연구를 통해 개발된 방향족 고분자 생산 기술은 다양한 비천연 고분자들의 생산이 가능한 플랫폼 기술이다. 따라서 해당 기술을 활용하여 석유 기반의 고분자를 대체할 고가의 의학용 고분자, 친환경 소재 등 다양한 재료들을 보다 친환경적으로 생산하여 바이오 플라스틱 산업의 확장에 기여할 것으로 기대한다.


참고문헌
1. Yang JE, Kim JW, Oh YH, Choi SY, Lee H, Park A-R, Shin J, Park SJ, and Lee SY (2016). Biosynthesis of poly(2-hydroxyisovalerate-co-lactate) by metabolically engineered Escherichia coli, Biotechnol. J. 11(12): 1572-1585.
2. Luengo JM1, García JL, Olivera ER (2001). The phenylacetyl-CoA catabolon: a complex catabolic unit with broad biotechnological applications. Mol Microbiol. 39(6): 1434-1442.




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