CRISPR/Cas9 시스템 역효과 규명 및 발현 최적화를 통한 유전체 편집 효율 및 속도 향상

한국과학기술원 조병관 교수

Cho S, Choe D, Lee E, Kim SC, Palsson BØ, Cho BK (2018) High-level dCas9 expression induces abnormal cell morphology in Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2018 7(4):1085-1094

1. 연구배경

미생물의 면역 기작으로 알려진 CRISPR/Cas9 시스템은 특정한 유전 서열을 인식하여 DNA를 절단하는 기능을 가진다. 이 CRISPR/Cas9 시스템을 기반으로한 유전체 편집 기술은 미생물에서부터 인간 세포에 이르기까지 많은 생명체의 유전체 편집에 사용되고 있다. 하지만 CRISPR/Cas9 기반 유전체 편집 기술을 구축/이용하고 있음. 이 때, CRISPR/Cas9 시스템의 미생물에 대한 영향이 분석되지 않고 단순히 고발현되어 이용되고 있음. 이러한 고발현이 미생물 성장 저해 등의

역효과를 유발하는지에 대한 실험 및 연구가 필요함.

2. 연구내용

CRISPR/Cas9 시스템의 발현이 미생물에 미치는 영향을 분석하였다 (그림 1).

그림 1. CRISPR/Cas9 발현이 대장균에 미치는 영향

CRISPR/Cas9의 발현은 대장균의 성장 속도를 50% 이상 감소시켰으며, 세포의 형태가 비정상적으로 변형되었음 (그림 2).

그림 2. CRISPR/Cas9 발현으로 인한 세포의 성장 속도 및 형태 변화

비정상적인 성장과 변화된 세포 형태의 원인을 찾기 위하여 전사체 분석 및 ChIP-Seq 실험을 진행/분석하였다. 전사체 분석 결과 527개 유전자의 발현량이 유의한 수준으로 변화한 것을 발견하였으며, 탄소 대사, post-translational modification, 단백질 합성/분해 순환, chaperon 등의 관련된 유전자의 발현이 크게 증가한 것을 확인하였다 (그림 3). 반면에, 세포 움직임, 세포벽, 세포막 등과 관련된 유전자의 발현은 감소하였다 (그림 3).

그림 3. CRISPR/Cas9 고발현에 의해 유도된 전사체 변화

추가로 비정상적인 세포 형태와 (filamentous morphology) 관련된 유전자들을 추측할 수 있었는데, cedA, ycjY, blr, sdiA, yodD 등의 세포 분열과 형태에 관련된 유전자이면서 발현량이 유의하게 변화한 유전자였다.

그림 4. 세포 분열과 관련된 유전자 고발현시 나타나는 세포 형태 변화

실제로 해당 유전자들의 발현 변화가 세포 형태를 변화시키는지 알아보기 위하여 플라스미드 형태로 해당 유전자를 고발현하였을 때, cedA와 ycjY의 경우 세포 형태 변화를 유도하였다. 따라서 Cas9 발현에 의해 세포 분열 조절 단백질인 cedA와 ycjY의 고발현이 유도되고 이로인해 세포 형태가 변화한다는 것을 규명하였다.

Cas9이 어떻게 이러한 유전자 변화를 일으키는지 알아보기 위해, ChIP-Seq을 통해 Cas9이 유전체에 binding하는지 알아보았다 (그림 5). Cas9을 과발현하였을 때, binding specificity를 제공하는 gRNA가 없는 조건에서도 유전체의 특정 부분에 강하게 결합한다는 사실을 발견하였고, 해당 부분은 대부분 유전자의 프로모터 영역이었다. 유전자의 프로모터 영역에 단백질이 결합할 경우 유전자의 발현량에 큰 영향을 미치는데, 이로 인해 전사체 변화가 유도되었다는 것을 규명하였다.

그림 5. Cas9이 유전체에 binding하는 프로파일

Cas9 역효과는 Cas9이 과발현되었을 때만 관찰되었으며 (그림 5), 이 역효과를 피하면서도 유전체 편집에 이용하기 위해 발현량에 따른 유전체 편집 효율과 세포 형태, 성장속도를 측정하였다 (그림 6). 기본 수준의 발현량 (basal level)에서도 목적 유전자인 형광 유전자를 효과적으로 억제하였고, 세포 형태 역시 변하지 않은 것을 확인하였다.

그림 6. Cas9 발현량에 따른 목적 유전자 발현 조절

3. 기대효과

본 연구를 통해 무분별한 CRISPR/Cas9의 도입이 세포에 역효과를 줄 수 있다는 점을 세계 최초로 확인하였다. 고효율 유전체 엔지니어링을 위해서 이 현상을 이해하고, 해결방안을 도출해야하기 때문에 전사체 분석을 통해 성장 저해 및 분열 억제를 유발하는 유전자를 규명하였고, 이를 방지하기 위해 발현량 조절 방법 및 발현 수준에 대한 가이드라인을 제시하였다. 전세계적으로 광범위하게 사용되고 있는 CRISPR/Cas9 시스템과 전사체의 간섭에 대해 최초로 규명한 학술적 가치가 있으며, 유전체 편집에 의한 효과와 Cas9 과발현으로 인한 위양성(false-positive) 효과를 구별하여 더욱 정확한 유전체 편집이 가능할 것으로 생각되고 유전체 편집 속도 및 효율성을 향상시켜 연구 개발에 필요한 시간 및 자원 절약도 가능하다고 기대된다.