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       Cellulose Binding Domain 융합에 의한 효소 단백질 안정화
               
       ISBC        2018.09.14 11:31        55
 

Cellulose Binding Domain 융합에 의한 효소 단백질 안정화


한국생명공학연구원 김하성 박사


Soo-Jin Yeom, Gui Hwan Han, Moonjung Kim, Kil Koang Kwon, Yaoyao Fu, Haseong Kim, Hyewon Lee, Dae-Hee Lee, Heungchae Jung, Seung-Goo Lee. Controlled Aggregation and Increased Stability ofβ-Glucuronidase by Cellulose Binding Domain Fusion, Plos One, 2017.


1. 연구배경


Cellulose binding domains (CBDs) 는 cellulose 분해효소의 일부 도메인으로 복합체를 형성하여 기질 근처 효소의 농도를 증가시킴으로서 효소 활성을 높이는 역할을 한다. 본 연구그룹은 기존 연구에서 Cellulomonas fimi 유래의 family II CBD를 Escherichia coli 유래 세포질 단백질과 융합할 경우 활성형 융합체를 형성함을 보였고 [1, 2] 이번 연구는 효소 활성을 증가시켜주는 새로운 Matrix로서 CBD의 가능성을 검증한 연구이다. 연구에서 사용한 타깃 효소는 in vitro에서 진화기반 단백질 연구에 모델 시스템으로 널리 연구되는 효소중 하나인 E. coli 유래 beta-Glucuronidase (GusA) 이다 [3, 4]. GusA의 활발한 연구에도 불구하고 이 단백질 자체의 불안정성으로 인한 높은 false positive 비율이 고속 스크리닝의 한계로 지적되고 있다 [4]. 본 연구는 이러한 GusA를 CBD와 융합한 GusA-CBD 단백질의 활성 및 특성을 분석하여 free GusA와 비교를 수행하였고 결론적으로 family II CBD 단백질을 융합 파트너로 사용하여 GusA와 같은 타깃 효소 단백질의 안정성이 강화되고 활성형 효소 고정화 matrix로 응용 가능성이 높음을 보인 연구이다. 


2. 연구결과


GusA-CBD의 자가조립 (Self-assembly) 현상


GusA의 C말단과 N말단에 CBD를 융합한 GusA-CBD와 CBD-GusA, 그리고 free GusA를 저온에서 발현 후 His-tag 정재를 수행하여 specific activity를 측정한 결과 각각 약 102, 19, 4.3 units mg-1로 나와 이후 융합단백질 실험은 GusA C말단에 CBD가 융합된 GusA-CBD로 수행하였다. Gel filtration chromatography를 이용한 native molecular mass 측정 결과 GusA와 GusA-CBD 각각 290와 83000 Da로 GusA는 tetramer로 GusA-CBD는 monomer로 존재하는 것으로 관측되었고 이는 CBD 융합이 oligomerization을 어렵게 하는 것으로 판단되었다 (그림 1).

그림 1. Gel filteration chromatography를 이용한 native GusA와 GusA-CBD를 이용한 molecular mass 측정.


특정 조건에서 정재된 CBD의 경우 자가조립 (self-assembly) 현상을 보이고 GusA-CBD도 동일한 특성이 있는지 검증하기 위하여 정재된 GusA-CBD를 4oC에서 12시간동안 처리하였고 gel filtration chromatography를 이용한 분석 결과 효소 융합체로서 자가조립 현상이 보임을 확인 하였다 (그림 2)

그림 2. Native GusA-CBD의 분자량과 (Red) 4도 12시간 처리 후 oligomer GusA-CBD (Blue)


자가조립된 GusA-CBD의 활성 검증


GusA는 다양한 상용 기질들을 이용한 쉬운 assay법에 의해 널리 사용되는 리포터 중 하나이다. 본 연구에서는 활성화 측정 기질로 pNP-glucuronide를 사용하였고 GusA-CBD의 해당 기질에 대한 효소 활성의 최적 pH와 온도를 측정하였다. 그 결과 free GusA의 최적 온도와 pH가 60도와 7.5인 반면 GusA-CBD의 경우 60~70도와 pH6.0의 최적 온도 및 pH를 갖는 것을 관찰하였다 (그림 3).

그림 3. Free GusA (red)와 GusA-CBD (black)의 pNP-glucuronide에 대한 최적 활성 온도 및 pH 비교


위 결과에 의하면 GusA-CBD는 free GusA에 비해 높은 온도 및 낮은 pH에서 최적의 활성을 보이며 이는 해당 조건에서 더 안정하다는 것을 암시한다. 이에 열과 pH에 대한 안정성을 비교하기 위해 다양한 온도에서 두 단백질의 half life를 비교한 결과 GusA-CBD가 GusA에 비해 45, 50, 55, 60도의 온도에서 모두 현저히 높은 수치를 보였고 pH의 경우도 pH 5.5 이하에서 free GusA가 12시간 후 약 40% 활성만 보인 반면 GusA-CBD는 12시간 후에도 계속해서 활성을 보였다 (그림 4). 또한 methanol solvent와 protinase K에 대한 안정성을 측정해 본 결과 동일 methanol 농도 조건에서 GusA-CBD가 free GusA에 비해 30% 높은 활성을 유지하고 있었으며 protinase K 0.5mg/mL 이상의 농도에서 fre GusA의 경우 완전히 활성을 잃었지만 GusA-CBD의 경우 계속해서 활성이 남아 있음을 보였다 (그림 4).

그림 4. 다양한 pH와 protinase K 농도 조건에 의한 GusA (open circle)와 GusA-CBD (closed circle)의 활성 측정


3. 연구의 성과 및 의의


바이오산업의 측면에서 효소의 안정성을 높이는 연구는 반응 생산물의 경제성과 직접적으로 연관된 매우 중요한 이슈 중 하나이다. 본 연구에서 사용된 E. coli 유래 GusA 또한 그 안정성을 향상시키기 위해 다양한 방법으로 개량이 되어왔으나 여전히 높은 비율의 false positive로 인한 계량의 한계가 알려져 있다. 본 연구에서는 간단히 GusA의 C말단에 CBD를 융합하여 GusA가 높은 안정성을 갖게 되는 특성들을 관찰할 수 있었다. 특히 고온에서 안정한 GusA 변이를 탐색하는 연구에서 [4] GusA가 oligomerization을 형성하는 것이 monomer로 빠르게 돌아가려는 성질을 막아 GusA의 안정성 증가의 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나 이 또한 70도 이상에서는 다시 monomer로 전환되어 안정성이 떨어지는 문제가 있음을 확인했다. 본 연구의 GusA-CBD의 경우 70도 이상에서도 oligomer 상태를 유지하는 것을 확인했으며 이는 CBD의 활성형 응집체 성질에 의한 안정성 효과의 증가라고 볼 수 있다. 따라서 GusA 외 다양한 효소의 CBD와의 융합으로 E. coli 내에서 이들의 고정화 효과를 기대할 수 있으며 이로 인한 채널링 효과로 대사 반응의 속도 및 효율을 증가시킬 수 있는 중요한 가능성을 제시하고 있다. 


참고문헌
1. Choi S-L, Lee SJ, Yeom S-J, Kim HJ, Rhee YH, Jung H-C, et al. (2014) Controlled localization of functionally active proteins to inclusion bodies using leucine zippers. PLoS ONE 9: e97093. doi: 10.1371/ journal.pone.0097093 PMID: 24897378
2. Choi S-L, Lee SJ, Ha J-S, Song JJ, Rhee YH, Lee S-G (2011) Generation of catalytic protein particles in Escherichia coli cells using the cellulose-binding domain from Cellulomonas fimi as a fusion partner. Biotechnology and Bioprocess Engineering 16: 1173?1179
3. Mantis Joanna, Tague BW (2000) Comparing the utility ofβ-glucuronidase and green fluorescent protein for detection of weak promoter activity in Arabidopsis thaliana Plant Molecular Biology Reporter 18: 319?330
4. Xiong A-S, Peng R-H, Zhuang J, Chen J-M, Zhang B, Zhang J, et al. (2011) A thermostable b-glucuronidase obtained by directed evolution as a reporter gene in transgenic plants. Plos one 6: e26773. doi: 10.1371/journal.pone.0026773 PMID: 22096498 
 









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