저부가가치 바이오매스를 통한 고부가가치 자일론산의 생산을 위한

코리네박테리움 글루타미쿰의 개량

한국과학기술원 정기준 교수

Yim, S. S., Choi, J. W., Lee, S. H., Jeon, E. J., Chung, W. J., & Jeong, K. J. (2017). Engineering of Corynebacterium glutamicum for Consolidated Conversion of Hemicellulosic Biomass into Xylonic Acid. Biotechnology Journal. doi: [10.1002/biot.201700040]

1. 연구배경

단당류에서 전환하여 생산할 수 있는 당산 (sugar acid)은 많은 생리활성 기능과 더불어 차세대 화학물 생산에 있어 중요한 매개체 물질로 많은 연구가 이루어지고 있다. 포도당 (Glucose)의 경우 대부분이 사료나 식품에서 소비되기 때문에 당산을 생산하는데 경제성이 떨어진다. 자일로스 (Xylose)의 경우 포도당에 이어 2번째로 그 부존량이 풍부하며 비식량자원인 헤미셀룰로오스에 풍부한 자원이기 때문에 당산인 자일론산 (Xylonic acid)생산에 있어서 유리하다고 판단된다. 자일론산은 미국 에너지원이 선정한 중요 30가지 화학물 중에 하나이며, 생분해성 바이오플라스틱을 생산에 있어서 촉매제로 사용되고 고분자를 생산하기 위해서도 필요한 물질이다.

이를 생산하기 위해서 화학적, 생물학적 공정이 연구되었다. 화학적 생산 방법은 백금이나 금을 이용하여 전환하는 것인데 촉매 특이성이 낮기 때문에 낮은 전환율과 높은 공정 비용이 필요하다. 생물학적 공정은 미생물이 생산하는 효소를 통해 전환하는 것으로서 높은 전환율과 전환 과정에서 자일론산이 산화되는 정도가 낮기 때문에 높은 생산성을 보장한다. 하지만 선행기술은 고가의 정제과정을 거친 자일로스로부터 생산하였기 때문에 미생물이 탄소원으로 소모하기 때문에 전구체가 줄어들고 경제성 역시 떨어지게 된다.

2. 연구내용

본 연구에서는 효과적인 자일론산의 생산을 위해서 저렴한 비정제된 바이오매스인 헤미셀룰로오스로부터 자일로스를 얻고 이를 세포공정을 통해 자일론산을 생산하였다. 이를 수행하기 위해서 연구진은 두 가지 시스템을 도입해야했는데 I) 헤미셀룰로스인 자일란 (Xylan)을 분해하기 위한 효소 분비 및 자일로스 수송시스템, ii) 미생물이 효율적으로 자일로스를 자일론산으로 전환하는 시스템이다. 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)이라는 균주를 사용하였다. 이 균주는 아미노산이나 그람양성균으로써 아미노산 생산에 주로 사용되는 균주 이다. 제일제당, 대상, 삼양제넥스, 아지노모토, 쿄화 등 국내외 많은 회사에서 이 균주를 이용하여 Glutamate. Lysine, Tryptophan 등을 생산하고 있다. 또한, 그 자체로서 여러 고부가가치 바이오 화합물을 생산하는 데 강점을 가지고 있다. 또한 헤미셀룰로오스를 분해하면서 생기는 여러 가지 부산물인 유기산, 페놀, 리그닌에 대해 저항성을 가지고 있다. 마지막으로 바이오매스를 분해 효소를 효과적으로 분비할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰이 단백질 분비능력이 뛰어나기 때문에 헤미셀룰로오즈 분해에 필요한 여러 단백질을 분비 생산할 수 있을 것으로 예상되기 때문이다. 본 연구진은 선행연구를 통해서 이 박테리아가 헤미셀룰로오스를 분해하는 공정을 보여주었고 이번 연구를 통해서 더 나아가 더 활용된 연구를 진행하였다.

그림 1. 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 헤미셀룰로오스부터 자일론산 전환 모식도

○ 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 자일로산을 생산하는 과정을 모식도를 통해 표현하였다 (그림 1). 세포 밖에

    존재하는 바이오매스인 자일란을 분해하기 위해서는 두 가지 효소, endoxylanase (XlnA), xylosidase (XynB)가

    세포 밖으로 분비되어 다당류인 자일란을 단당류인 자일로스로 분해한다. 분해된 자일로스는 수송단백질인 xylose

    transporter (XylE)를 통해서 세포 내부로 들어올 수 있게되고 세포 내부에 발현된 xylose dehydrogenase (Xdh)를

    통해서 자일로산으로 전환되고 세포 성장은 포도당으로 이루어지기 때문에 자일로스의 손실은 없다.

○ 먼저 코리네박테리움 글루타미쿰에서 자일로스가 효과적으로 전환됨을 확인하기 위해서 본연구진은 xdh 발현시스템 

    을 제작하였다. 합성프로모터인 H36을 이용하여 발현하였고 유전자 발현을 돕기위한 T7 RBS와 His tag이 없는 시스템

    과 있는 시스템인 pX, pUX를 각각 제작하였다. (그림 2A). Xdh 발현 결과 pUX 플라스미드 시스템에서 고발현이 됨을

    확인하였다 (그림 2B). 이를 기반으로 자일로스 수송단백질인 XylE까지 도입한 pUXE를 제작하였다 (그림 2A).

그림 2. xylose dehydrogenas (Xdh) 효소 발현시스템 제작. A 제작 플라스미드 모식도 B xdh 효소 발현 결과 화살표는

           목적 단백질을 나타낸다. 1부터 3은 각각 pCES208; Negative control, pX, pUX 플라스미드를 가진에서 얻은 샘플

           을 나타낸다.

○ 외부로부터 자일로스를 넣어 자일론산을 생산한 결과. 대부분 플라스미드 시스템에서 세포 성장은 비슷하였으나 자일

    로스 수송단백질을 분비하는 pUXE시스템에서 약간의 느린성장을 보여주었다 (그림 3A). 포도당 소모역시 세포성장과

    동일한 패턴으로 pUXE 시스템에서 약간 느린 소모속도를 보여주었다 (그림 3B). 하지만 자일로스 소모속도와 자일론

    산 생산속도에서 pUXE가 다른 시스템보다 높은 생산성인 1.02 gL-1h-1을 보여주었는데 이는 다른 pX (0.53 gL-

    1h-1), pUX (0.77 gL-1h-1) 보다 높은 생산성이다 (그림 3CD).

그림 3. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 자일로스로부터 자일론산 생산 결과 A 생장그래프 B 포도당 소모 그래프 C 자일

           로스 소모 그래프 D 자일론산 생산 그래프 ○: pCES208; Negative control ▲: pX ■: pUX ●: pUXE

○ 최종적으로 헤미셀룰로오스를 분해하여 자일론산 생산을 하기위해 자일로스 분해효소 분비시스템을 도입하여 pUXED

    플라스미드 시스템을 제작하였다. 자일란 분해 효소는 선행 연구를 통해 제작한 최적의 분비 신호서열을 통해 분비되는

    XlnA와 XynB이다 (그림 4A). pUXED는 생산하는 외래 단백질이 많기 때문에 약간 느린 생장속도와 낮은 포도당 소모 

    속도를 보여주었지만 (그림 4BC), 헤미셀룰로오스를 분해하여 자일로스를 얻을 수 있기 때문에 자일론산을 생산할 수

    있었다 (그림 4D). 20 g의 헤미셀룰로오스를 이용하여 50 시간만에 6.23 g L-1에 도달하였다. 이는 전 세계 최초로 코

    리네박테리움 글루타미쿰을 이용하여 저부가가치인 헤미셀룰로오스로부터 고부가가치 산물인 자일론산을 생산한 결

    과이다.

그림 4. 헤미셀룰로오스를 분해하여 자일로스로부터 자일론산 생산 결과 A pUXED 플라스미드 모식도 B 세포 성장 그래

           프 C 포도당 소모 그래프 D 자일론산 생산 그래프 ○: pCES208; Negative control ▲: pUXE ■: pUXED

3. 기대효과

본 연구에서는 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용해 바이오 플라스틱과 의약품으로 사용될 수 있는 자일론산을 비정제된 바이오매스로부터 생산하였다. 이는 저가의 원료로부터 고부가가치 산물을 생산하는 결과를 고효율로 보여주었다. 본 결과를 통해 높은 생산 전환율은 산업화 가능성을 높게 보여주고 있으며 앞으로 바이오매스 전환연구에 적용할 수 있는 기술로 기대된다.

참고문헌

1. Yim, Sung Sun, et al. \"Modular optimization of a hemicellulose-utilizing pathway in Corynebacterium   

    glutamicum for consolidated bioprocessing of hemicellulosic biomass.\" ACS synthetic biology 5.4 (2016):

    334-343. doi: [10.1002/biot.201700040]
2. Yim, S. S., Choi, J. W., Lee, S. H., Jeon, E. J., Chung, W. J., & Jeong, K. J. (2017). Engineering of

    Corynebacterium glutamicum for Consolidated Conversion of Hemicellulosic Biomass into Xylonic Acid.

    Biotechnology Journal. doi: [10.1002/biot.201700040]