왼쪽 메뉴 타이틀 이미지
주요성과

Home < 주요성과 < 주요성과

       생물 친화적인 Fe2O3 요크쉘 입자의 대규모 에어로졸 보조 합성: 효소 고정화를 위해 유망한 지지체
               
       ISBC        2018.09.04 17:43        68
 

생물 친화적인 Fe2O3 요크쉘 입자의 대규모 에어로졸 보조 합성:

 효소 고정화를 위해 유망한 지지체


건국대학교 이정걸 교수


Sanjay K. S. Patel,  Seung Ho Choi,  Yun Chan Kang, Jung-Kul Lee* (2016) Large-scale aerosol-assisted synthesis of biofriendly Fe2O3 yolk–shell particles:  promising support for enzyme immobilization. Nanoscale 2016 Fed 25; 8.12: 6728-673, DOI: 10.1039/C6NR00346J.


1. 연구배경


나노 입자는 높은 표면적 및 다공성과 같은 독특한 특성 때문에 산업과 생물 의학 분야에서 매력적인 재료이다. 새로운 유형의 나노 물질을 개발하기 위한 나노 기술 분야의 연구는 필요성의 증가에 따라 보다 활발히 연구가 진행되고 있다. 한편, 효소는 우수한 생체 촉매로 다양한 산업적 용도를 가지나, 산업적인 적용에서 순수 효소의 사용은 민감성, 재사용성 및 높은 비용에 의해 제약이 있는 실정이다. 그러므로, 다양한 나노구조체에의 효소 고정화는 효소의 민감성, 재사용성 등을 극복하기 위한 유망한 방법이다. 최근의 다양한 고정화 기술은 효소의 안정성을 향상시키기 위해 효소의 물리적, 공유적 또는 친화적인 상호 작용을 기반으로 개발된 것이다. 나노 입자 기반 고정화 지지체는 지난 몇 십 년 동안 구형, 코어-쉘, 중공, 튜브 그리고 양파 등과 같이 구조화되고, 형태학적으로 구별되는 많은 나노 입자들이 고정화를 위해 사용되어 왔다. 고정화 효율을 높이기 위해 다양한 접근법이 사용되었지만, 고부하 및 고효율을 달성하기 위해 보다 효율적인 신규 고정화 시스템의 확보가 요구된다. 또한, 지지체 입자는 본질적으로 환경친화적이어야 하며 생체 적합해야 한다.


실용적 효소는 그 특성을 향상시키기 위한 고정화의 모델로서 널리 선택되는데, 그 중에 Horseradish peroxidase (HRP), Glucose oxidase (GoX), 라카아제는 산업 및 환경 응용 분야에서 중요한 효소이다. 최근 페놀 및 합성 염료와 같은 독성 화합물의 분해와 관련된 환경 문제가 증가함에 따라, 라카아제는 페놀 계 및 비 페놀 계 화합물의 산화에 대한 광범위한 기질 특이성 때문에 이점을 갖는다. 신규 요크쉘 구조체는 요크쉘 내부뿐만 아니라 표면 양쪽에 결합 된 효소에 더 높은 안정성을 제공한다. 다중 껍질을 지닌 요크쉘 구조체에 대한 효소 고정화 연구는 현재까지 보고 된 바 없다. 또한, 효소 반응 후에 쉽게 회수할 수 있는 자성 요크쉘 구조에 대한 효소 고정화는 지금까지 발표된 바 없다. 따라서 다중 껍질을 지닌 요크쉘 자기 분말의 합성과 응용은 과학적 및 산업적으로 큰 의미를 갖는다.


본 연구에서는 새로운 다중 껍질 Fe2O3 요크쉘 입자를 덱스트린을 탄소원으로 사용하는 분무 건조 공정에 의해 제조한 후, 모델 효소들인 GoX, HRP, 라카아제를 다중 껍질 Fe2O3 요크쉘 입자에 효율적으로 고정화한 결과를 최초로 보고하였다. 즉, Fe2O3 요크쉘 입자에 모델 효소들을 고정화하였을 때 이전의 수많은 보고들과 비교하여 월등히 효율적인 결과를 얻었다. 특히 다중 껍질 Fe2O3 요크쉘 입자에 고정화된 라카아제는 글루타르 알데히드로 추가 교차 결합시켰을 때, 합성 염료의 탈색, 페놀의 산화 및 비스페놀 A 분해력, pH 내성, 열 안정성, 용매 안정성 및 재사용 성이 현저히 향상되었다. 향상된 자기적 성질, 전기 화학적 성질, 저독성을 지닌 다중 껍질 Fe2O3 요크쉘 입자는 산업적으로 중요한 효소의 고정화 및 응용을 위한 적절한 대안을 제공할 것이다.


2. 연구결과


모식도에서 보이는 대로 요크쉘 Fe2O3 입자에 대한 철 질산염 및 덱스트린을 포함하는 전구체 입자는 분무-건조 시스템을 사용하여 준비하였다 (그림 1).

그림 1. 효소 고정화와 연속적인 가교결합 (cross-linking) 과정을 수행하는 다중 막 Fe2O3 요크쉘 입자의 합성 과정을 보여주는 모식도


X-ray 회절분석법으로 후처리된 입자의 XRD 패턴을 분석한 결과 후 처리 온도에 관계없이 Fe2O3의 순수 능면체 결정 구조를 보였다 (그림 2a). 300, 400 및 500oC의 온도에서 후 처리 된 요크쉘 구조인 Fe2O3 입자 (300A, 400A, 500A)의 BET 표면적은 각각 24.4, 15.1 및 19.5 m2g-1 이었다 (그림 2b). 즉, 더 낮은 온도 (300oC)에서 제작했을 때 표면적이 증가하는 것을 볼 수 있다.


그림 2. 다른 온도에서 분무 건조 방식으로 만들어진 Fe2O3 요크쉘 입자들의 특성. (a) X-ray 회절분석법 (XRD 패턴), (b) 질소 흡착- 탈착 등온선 (nitrogen adsorption-desorption isotherms; BET)


이들 효소의 최대 적재량은 각각 라카아제, HRP 및 GOx에 대해  398, 307 및 292 mg g-1의 지지체였다. 여기서, 이들 효소의 Fe2O3 요크쉘 입자상에의 상대적 적재량은 순수 또는 복합 자성 입자에 고정하는 것에 대한 이전의 연구에서 보고된 것 보다 현저하게 높다. 라카아제 고정화의 경우 약 22배, HRP의 경우 40배, 그리고 GOx의 경우 6배 적재가 증가되었다. (그림 3)


그림 3. Fe2O3 요크쉘(A300)에 모델 효소의 고정화 수유 (a), 시간에 따른 (b) 적재량 (loading)


효소 고정 후, C, N 그리고 O에 대한 에너지 분산 분광 분석에서 원소 조성의 증가가 관찰되었다. 또한 요크쉘 Fe2O3 입자에 고정화된 라카아제의 FT-IR 스펙트럼에서 1600-1800 cm-1 에서 N=C=O 흡광의 존재는 라카아제가 성공적으로 고정화되었음을 나타낸다. 고정화 된 라카아제의 높은 적재는 열중량 분석기 (Therapeutic Goods Administration; TGA) 분석 시, 순수한 요크쉘 입자에서 88.9%로 손실된 중량과 비교하여 59.5%까지 상대 중량의 현저한 감소로 확인되었다. 다중층 Fe2O3 요크쉘 입자의 다중층 내부 및 외부로의 효소 고정화는 TEM 및 원소 맵핑을 통해 최초로 확인하였다. (그림 4).

그림 4.  다중층 요크쉘 입자 (A300)에 고정화 된 라카아제의 TEM (a-d) 및 원소 맵핑 (e-h)


Free 라카아제의 Km 값과 Vmax 값은 각각 29.3 µM과 1890 µmol min-1 mg protein-1이었으며, 고정화 후 교차 결합된 라카아제는 41.5 mM과 1722 µmol min-1 mg protein-1의 Km 및 Vmax 값을 각각 보유했다. 기존 문헌에서는 고체 지지체에 라카아제를 고정시킨 후 Km 값이 10 배까지 증가하고 Vmax 값이 현저히 감소한 것과 비교할 때 월등히 우수한 결과이다.


고정화 라카아제는 약 95%의 잔류 활성을 유지한 것에 반해, free 라카아제는 25oC 에서 4 일 후에 활성의 90% 이상을 잃고 10% 미만의 잔류 활성을 나타내었다 (그림 5a). ABTS의 산화 시, 단순 고정화 효소의 경우 5 및 10 cycle 후 각각 88.6% 및 70.6%의 잔류 활성을 나타낸 반면, 교차결합 시에는 97.1%와 93.1%의 잔류 활성을 유지했다 (그림 5b). 이러한 결과는 교차 결합이 고정화된 라카아제의 재사용 도중, 높은 안정성과 감소된 침출을 제공했다는 것을 의미한다.

그림 5. Fe2O3 요크쉘 입자에 고정화 된 라카아제 (immobilized, free, cross-linked)의 안정성과 재사용성 :

 (a) 25 oC에서 안정성 (b) 재사용성


교차 결합된 라카아제에 의한 크실렌 시아놀과 CBBR-250 염료의 최대 탈색은 24 시간 배양 후 각각 83.7 및 71.1%로서, 이 값은 free 라카아제에서 얻은 값에 비해 최대 3 배까지 높다. 교차 결합된 라카아제는 50-150 μM의 농도 범위에서 자유 효소보다 더 효율적으로 비스페놀 A를 분해했다. 합성 착색제의 탈색과 비스페놀 A의 분해에서, 교차결합된 라카아제에 의한 개선은 그것의 높은 안정성에 기인한다.


고정화 라카아제는 자유 효소보다 ABTS에 대해 0.62 및 0.54V의 높은 산화와 환원 전위를 나타내었으며, ABTS의 산화 환원 전위의 변화는 주로 요크쉘 입자에 기인한 것이다. Free 및 고정화 라카아제의 최대 양극 정점 전류는 ABTS (0.5 mM)의 촉매 산화에 대해 각각 0.22 및 1.54 μA이었으며 (그림 6a), 이러한 결과는 요크쉘 입자에 고정화된 라카아제가 ABTS의 산화에 대해 7 배 더 효율적이라는 것을 의미한다. ABTS 검출의 선형 범위는 고정화 및 free 라카아제의 경우 각각 10-250 μM 및 10-75 μM로서 (그림 6b), 고정화 라카아제가 free 효소보다 넓은 범위의 ABTS 검출에 더 효율적이다.

그림 6. Free 및 고정화 라카아제의 전기적 특성. (a) 유리탄소 전극 (GCE)의 cyclic voltammogram 곡선, ABTS (0.5 mM)를 포함한 버퍼에서 GCE/Fe2O3 요크쉘 입자, GCE/free 라카아제, GCE/immobilized 라카아제, (b) 다양한 농도에서 free 및 고정화 라카아제의 산화 전류.


3. 연구의 성과 및 의의


다중층 요크쉘 입자는 여러 모델 효소가 고정화 된 후 기존의 많은 자성 복합 입자보다 높은 적재 용량 및 잔류 활성을 나타냈다. 그것은 다중층 요크쉘이 상업적으로 이용 가능한 구형 입자를 포함한 다른 나노 입자보다 훨씬 더 효율적인 지지체임을 의미한다. 고정화된 효소의 교차 결합은 합성 염료의 탈색 및 비스페놀 A의 분해와 같은 효율적인 적용을 용이하게 하는 효소의 특성을 현저히 개선시켰다. 또한, 일반적으로 사용되는 용매에서의 높은 안정성은 다양한 산업에서 유래된 독성 화합물을 효율적으로 처리할 수 있는 광범위한 응용 분야에 적합한 대체 생체 촉매를 제공한다. 지지체로서의 향상된 전기 화학적 성질을 갖는 생체 적합성 Fe2O3 요크쉘 입자에 상업적으로 중요한 효소의 고정화는 다양한 산업 분야에서 유망한 접근법을 제공할 것이다.


참고문헌
1. R. C. Rodrigues, C. Ortiz, A. Berenguer-Murcia, R. Torres and R. Fernandes-Lafuente, Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem. Soc. Rev. 42, 6290-6307 (2013).
2. X. W. Lou, L. A. Archer and Z. C. Yang, Hollow micro‐/nanostructures: Synthesis and applications. Adv. Mater. 20, 3987-4019 (2008).
3. Y. Zhang, J. Zhang, X. Huang, X. Zhou, H. Wu and S. Guo, Assembly of graphene oxide–enzyme conjugates through hydrophobic interaction. Small, 8, 154-159 (2012).
4. W. J. Stark, P. R. Stoessel, W. Wohlleben and A. Hafner, Industrial applications of nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 44, 5793–5805 (2015).
5. R. G. Chaudhuri and S. Paria, Core/shell nanoparticles: classes, properties, synthesis mechanisms, characterization, and applications. Chem. Rev. 112, 2373–2433 (2012).







Total:32 page:(2/1)
32 정보 ISBC 금속항상성을 활용한 방선균의 대사생리 조절 18.09.14 48
31 정보 ISBC Cellulose Binding Domain 융합에 의한 효소 단백.. 18.09.14 56
30 정보 ISBC 항생제 생산 최적화를 위한 방선균 유전적 도구 .. 18.09.14 50
29 정보 ISBC 생물 친화적인 Fe2O3 요크쉘 입자의 대규모 에어.. 18.09.04 69
28 정보 ISBC 항생제 생산 최적화를 위한 방선균 유전적 도구 .. 18.09.04 57
27 정보 ISBC 저비용 고효율 맞춤형 미생물 검색 플랫폼 개발 18.09.04 52
26 정보 ISBC 코리네박테리움 글루타미쿰에서 헤미셀룰로오스 .. 18.09.04 52
25 정보 ISBC 항생제 생합성 방선균 유전자 발현 조절 규명 18.09.04 43
24 정보 ISBC NK cell에서 NF-κB의 단계적 인산화와 조절을 통.. 18.09.04 50
23 정보 ISBC Cross linker를 통해 안정화되는 융합 알파헬릭스.. 18.09.04 66
22 정보 ISBC 전사체 분석과 DNA-free CRISPR 시스템을 이용한 .. 18.09.04 66
21 정보 ISBC Antisense RNA 기반 정족수인식 차단효소 고속다.. 18.08.30 47
20 정보 ISBC 유전자 발현 패턴을 이용한 약물표적적합성의 개.. 18.08.30 52
19 정보 ISBC 당 감지 고감도 FRET 단백질 센서 및 소형 감지 .. 18.08.30 62
18 정보 ISBC 대장균 총유전체내의 ArgR 전사인자와 DNA 결합체.. 18.08.30 56
17 정보 ISBC 종양 혈관의 신생과 진행을 효율적으로 억제하는 .. 18.08.30 40
[1] [2]