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       저비용 고효율 맞춤형 미생물 검색 플랫폼 개발
               
       ISBC        2018.09.04 15:27        53
 

저비용 고효율 맞춤형 미생물 검색 플랫폼 개발


한국생명공학연구원 김하성 박사, 이승구 박사


Haseong Kim, Eugene Rha, Wonjae Seong, Soo-Jin Yeom, Dae-Hee Lee, and Seung-Goo Lee*, A Cell-Cell Communication-Based Screening System for Novel Microbes with Target Enzyme Activities. ACS Synth. Biol., 2016, 5 (11), pp 1231?1238


1. 연구배경


미생물은 지구상 생명체 무게의 60%를 차지할 정도로 무한하며 기후변화에서 질병에 이르기까지 거의 모든 생명현상에 관련되어 있다. 최근 인체/가축/작물에 공생하며 건강에 기여하거나 자연환경을 정화하고 C1가스 등 탄소자원을 유용 화학물질로 전환하는 미생물기술의 개발에 대한 관심이 높아지고 있다. 이러한 미생물의 활용가치는 무한히 풍부한 유전자 기능에 따른 것이며, 이는 전자산업의 반도체기술처럼 바이오산업에서도 미생물과 효소자원의 확보가 중요한 이유이다. 그러나 전통적인 미생물자원 확보기술은 특정한 몇몇 단백질들의 활성을 노동집약적으로 측정하거나 고가의 자동화 장비에 의존하고 있으며, 미생물의 생화학적 기능을 직접 관찰할 수 있는 기술은 극히 제한되어 있다. 


본 연구진은 탐침물질(designed substrates)에 반응하여 유전자회로를 구동시킴으로써 미지의 미생물 또는 효소의 기능을 대량으로 탐색할 수 있는 유전자회로(genetic circuits)를 개발하였다 [1, 2]. 이는 탐침물질이 특정 생화학적 효소 활성에 의해  미생물간 통신용 신호물질로 변환되어 근접한 미생물이 형광단백질과 필수영양소를 만들어 내도록 유도하는 방법으로 해당 미생물을 명확하게 가시화 하는 효과와 분자영상기술을 적용한 것이다. 이 방법을 이용하여 공장 근처 하수토양 유래 미생물 군을 고상 배양한 후 탐침물질 (탈인산효소 감지를 위한 phenyl-phosphate)과 페놀감지 유전자회로를 장착한 대장균을 처리하였다. 시료 중에 탈인산효소를 보유한 미생물이 존재하는 경우 해당 미생물의 주위에 형광색 동그라미가 형성되어 활성이 없는 세포들과 시각적으로 확연히 구분되었고 탈인산활성을 갖는 신규 미생물을 용이하게 확보할 수 있음을 보였다.


2. 연구결과


먼저 개발한 유전자회로의 작동을 검증하기 위하여 tyrosine phenol-lyase (TPL) 효소를 보유한 미생물을 TPL의 기질인 tyrosine (탐침물질)과 함께 고상배지에 배양하고 유전자회로를 탑재한 대장균 센서세포를 공배양 한 경우 TPL이 탐침물질에 작용하여 phenol을 만들어내고 그 주위에서 배양된 대장균 세포들에서 형광을 보이는 결과를 얻을 수 있었다 (그림 1).



그림 1. 감지센서 작동 모식도: 후보 미생물이 탐침물질(designed substrates)에 작용하는 경우 신호물질(phenol)이 만들어지고 센서미생물 내 유전자회로는 이에 반응하여 필수영양소 생산(D-AAT) 및 형광신호(GFP)를 발생시킴. 이러한 원리에 의해 특정 미생물 주변에 형광동그라미가 생겨나므로 목표한 효소활성을 손쉽게 확인 할 수 있음.


이러한 세포내 효소활성을 감지하는 방법은 미지의 미생물과 탐침물질 그리고 센서 미생물을 고상 배지에서 같이 배양하는 매우 간단한 방법이며 고가의 형광 분석기 (sorter)가 필요 없이 보급형 형광 이미지 분석기로도 쉽게 활성 미생물을 얻을 수 있다는 장점이 있다 (그림 2).

그림 2. 간단한 실험방법: 미생물 군집을 고상배지에서 키운 후 탐침물질과 유전자회로 탑재 대장균을 스프레이로 처리함. 하루 배양 후 이미지를 분석하고, 필요 시 유전자 분석 진행.


실제 이 방법을 이용하여 탈인산효소의 활성을 갖는 균주를 탐색하였다. 먼저 공장근처 하수 토양에서 얻은 미생물 군을 탄인산효소의 탐침물질 (phenyl-phosphate)와 함께 고상 배지에 배양하고 일정 시간이 지난 후 유전자회로를 장착한 센서세포를 처리하였다. 시료 중에 탈인산효소를 보유한 미생물이 존재하는 경우 해당 미생물의 주위에 형광색 동그라미가 형성되어 활성이 없는 세포들과 시각적으로 확연히 구분되었고 이들을 단일 콜로니로 선별하여 세포 파쇄액의 실제 탈인산화 효소 활성을 측정한 결과 선별 콜로니의 약 70%이상이 해당 효소의 활성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.



그림 3. 하천 토양에서 탈인산화 미생물기능 분석. (A) 신탄진 갑천 인근의 하수 토양 미생물 군집에서 phosphatase 활성 분석. 센서세포에 의해 형광을 보이는 24개 콜로니 선택 (B) 선택된 미생물들의 파쇄액에서 phosphatase 활성을 직접 측정한 결과 선택된 미생물 중 약 70% 이상의 개체에서 phosphatase 활성이 관찰됨.


3. 연구의 성과 및 의의


본 기술은 탐침물질만 변경하는 방법으로 동시에 다양한 효소활성을 분석할 수 있으며, 최소 300여 종의 다양한 효소활성에 적용할 수 있는 높은 확장성을 갖는 기술이다. 이를 동물의 장내미생물이나 극한환경미생물 등에 적용하면 미생물군집 분석, 바이오촉매 확보 및 대사경로개발 등에 기여할 것으로 예상된다.


또한 본 기술은 감지/신호증폭/세포간통신/가시화 등의 인공 기능을 유전자회로에서 구현한 합성생물학기술로서 이 회로를 도입한 대장균은 고가의 장비나 숙련이 없이도 원하는 기능의 미생물을 쉽게 발굴할 수 있다. 특히 기존기술과 달리 세포 파쇄나 DNA 추출 과정 없이 살아있는 그대로의 미생물을 빠르게 관찰할 수 있다는 점에서 활용 가치가 높다고 할 수 있다.


참고문헌
1. Haseong Kim, Eugene Rha, Wonjae Seong, Soo-Jin Yeom, Dae-Hee Lee, and Seung-Goo Lee*, A Cell-Cell Communication-Based Screening System for Novel Microbes with Target Enzyme Activities. ACS Synth. Biol., 2016, 5.11, 1231?1238
2. Su-Lim Cho, Eugene Rha, Sang Jun Lee, Haseong Kim, Kilkoang Kwon, Young-Su Jeong, Young Ha Rhee, Jae Jun Song, Hak-Sung Kim, and Seung-Goo Lee. Toward a generalized and high-throughput enzyme screening system based on artificial genetic circuits. ACS Synth. Biol., 2013 3.3, 163-171.








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