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       코리네박테리움 글루타미쿰에서 헤미셀룰로오스 대사회로 최적화를 이용하여 바이오매스 통합공정의 구축
               
       ISBC        2018.09.04 15:23        52
 

코리네박테리움 글루타미쿰에서 헤미셀룰로오스 대사회로 최적화를 이용하여

바이오매스 통합공정의 구축


한국과학기술원 정기준 교수



Sung Sun Yim, Jae Woong Choi, Se Hwa Lee, Ki Jun Jeong* (2016) Modular Optimization of a Hemicellulose-Utilizing Pathway in Corynebacterium glutamicum for Consolidated Bioprocessing of Hemicellulosic Biomass. ACS synthetic biology 2016 April 5.4: 334-343 DOI: 10.1021/acssynbio.5b00228.


1. 연구배경


다양한 바이오매스 중에서도 리그노 셀룰로오스는 목재나 농작물에서 얻을 수 있는 가장 흔하고 쉽게 얻을 수 있는 바이오매스이다. 이전에 이러한 목질계 바이오매스는 열에너지를 얻기 위한 수단에 불과했었지만 생물공학 발전이후 미생물 발효를 통해 다양한 고부가가치 물질을 생산하거나 바이오 연료를 생산할 수 있었다. 최근 미국에서는 석유화학공업에서 바이오 에탄올의 비율을 의무적으로 포함하게 하는 신재생연료 의무혼합제도 ((Renewable Fuels Standards, RFS)의 도입이 예정되어 있어 바이오매스를 이용한 연구가 중요해지고 있다.


헤미셀룰로오스를 포함한 목질계 바이오매스를 이용하는 공정은 크게 3가지로 구성된다. (1) 바이오매스를 분해하기 위한 효소를 생산 공정 (2) 효소를 이용하여 바이오매스를 분해를 통한 단당류 생산 공정 (3) 바이오매스 기반 단당류를 이용하여 최종 산물인 바이오 케미컬과 바이오 에탄올 생산 공정. 이러한 개별적인 공정을 거쳐야 하는데 이는 경제적이고 효율적인 공정을 구축하는데 있어서 해결해야 할 문제이다. 


본 연구에서는 이 문제의 해결책으로 통합형 공정 시스템 (Consolidated bioprocess, CBP)를 도입하고자 한다. 통합형 공정이란 앞서 말한 3가지 개별적인 시스템을 한 발효기 안에서 진행하여 공정을 최소화하고 효율성을 높이고자 하는 것을 말한다. 더 자세히 말하자면 바이오매스를 분해하기 하는 효소를 따로 생산 및 처리하는 공정 없이 발효공정의 미생물이 자체적으로 효소를 생산하여 분해하여 단당류를 이용하고 이를 이용하여 최종적으로 목표 산물을 생산하는 것이다. 이를 위해서는 균주의 능력이 매우 중요하다. 효율적인 효소 분비와 단당류를 이용하여 목표 화합물을 만들 수 있어야한다. 그래서 기존에는 Clostridium thermocellum, Clostridium cellulovorans, Thermobi?da fusca와 같은 자체 바이오매스 분해 능력이 있는 균주를 이용하였다. 하지만 이들 균주는 연구가 잘되어있지 않아 플라스미드나 유전자 조작이 쉽지 않다. 그렇기 때문에 기존에 많은 연구가 이루어진 모델 균주에 바이오매스 분해능을 가지게 하여 통합형 공정을 구축하고자하는 시도들이 이루어지고 있다.


본 연구에서는 새로운 헤미셀룰로오즈 분해 통합형 시스템을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 개발하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰은 그람양성균으로써 아미노산 생산에 널리 사용되는 균주 중에 하나이다. 제일제당, 대상, 삼양제넥스, 아지노모토 등 국내외 많은 회사에서 이 균주를 이용하여 MSG. Lysine, Tryptophan 등을 생산하고 있다. 이 박테리아는 헤미셀룰로오스를 분해하는 공정에서 많은 장점을 가지고 있다. 그 자체로서 여러 고부가가치 바이오 화합물을 생산하는 데 강점을 가지고 있다. 또한 헤미셀룰로오스를 분해하면서 생기는 여러 가지 부산물인 유기산, 페놀, 리그닌에 대해 저항성을 가지고 있다. 마지막으로 바이오매스를 분해 효소를 효과적으로 분비할 수 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰이 단백질 분비능력이 뛰어나기 때문에 헤미셀룰로오즈 분해에 필요한 여러 단백질을 분비 생산할 수 있을 것으로 예상되기 때문이다. 이러한 장점을 바탕으로 본 연구에서는 다양한 프로모터와 분비 펩타이드를 이용하여 각각의 헤미셀룰로오스 분해 단백질 분비, 단당류 수송 단백질 발현, 단당류 이용 단백질 발현을 최적화하여 세계최초로 코리네박테리움 글루타미쿰 기반 헤미셀룰로오스를 이용하는 통합형 공정을 구축하였다 (그림 1).


그림 1. 코리네박테리움 기반 헤미셀룰오스 통합형 공정의 모식도. 헤미셀룰로오스 분해 단백질 모듈 (XD), 단당류 수송 단백질 모듈 (XT), 단당류 이용 단백질 발현 (XU)를 표현하였다.


2. 연구결과


Xylose 이용 모듈의 최적화


본 연구진은 먼저 헤미셀룰로오스를 분해하여 얻어지는 단당류인 Xylose를 이용하는  코리네박테리움 글루타미쿰 시스템을 구축하였다. 야생형의 코리네박테리움 글루타미쿰은 Xylose 이용능력이 없기 때문에 이 모듈을 제작하여 효율적으로 Xylose를 이용하도록 제작하였다 (그림 2). 필요한 두 가지 효소인 XylA와 XylB를 3가지 다양한 세기의 합성 프로모터로 발현하였으며 이들의 발현과 생장속도를 측정하였다. pXU1는 L26, pXU2는 I16, pXU3은 H30 프로모터로 발현하였으며 각각의 프로모터 세기대로 발현되었다 (그림 2A). 하지만 Xylose를 이용한 생장 속도는 pXU2와 pXU3이 거의 차이가 없기 때문에 세포에 덜 부담을 주는 pXU2 모듈을 이용하고자 하였다 (그림 2B).

그림 2. Xylose 이용 모듈의 구축. A. XylA와 XylB의 발현 Western 결과. 1부터 4는 각각 공 플라스미드. pXU1, pXU2, pXU3을 나타낸다. 닫힌 삼각형은 XylA,열린 삼각형은 XylB를 나타낸다.  B. Xylose 기반 성장 곡선 그래프. 마름모는 공 플라스미드 삼각형은 pXU1, 동그라미는 pXU2, 사각형은 pXU3을 나타낸다.


Xylose 수송 모듈의 최적화


더욱 효율적인 Xylose 이용하기 위해서 Xylose 수송 단백질을 도입하였다. 총 3가지의 외래 수송 단백질을 도입하였다. C. glutamicum ATCC31831 유래의 AraE (AraE-C), Escherichia coli K-12 유래의 AraE (AraE-E) 와 XylE (XylE-E)이다. 이들 단백질을 각각 3가지 종류의 서로 다른 세기의 합성 프로모터인 L10, I12, H72로 발현하였다. 구축한 총 9 가지의 시스템을 이용하여 Xylose 기반의 생장곡선을 측정한 결과 pXU2T7 (L10 promoter로 XylE를 발현하고 I16 promoter로 XylA, XylB를 발현)하는 시스템이 가장 높은 생장 속도를 보여주었다 (그림 3).



그림 3. Xylose 수송 모듈 최적화. A. 다양한 수송단백질과 프로모터 조합을 통한 생장 속도 B. 생장 속도 그래프 C. Xylose 소모 그래프. ◇ 공 플라스미드 Δ, pXU2; ○, pXU2T7. 열린 표시는 3.6 g/L의 Xylose 닫힌 표시는 20 g/L의 Xylose


헤미셀룰로오스 분해 모듈의 최적화


헤미셀룰로오스 Xylan 분해를 위해서는 총 두 가지 효소가 필요하다. XlnA (Streptomyces coelicolor A3)와 XynB (Bacillus pumilus)를 효과적으로 분비하는 것이 필요하다. XlnA의 경우 Sec pathway로 분비되는 시스템을 이용하였고 XynB는 Sec pathway와 Tat pathway로 분비되는 시스템을 도입하였다. 최종 결과 XlnA는 Cg1514 분비 서열을 이용하여 제일 효과적으로 분비되었으며 XynB는  Tat 분비 서열인 CgR0949를 이용하여 강한 분비가 확인 되었다. 이를 통해 헤미셀룰로오스인 Xylan을 분해하여 Xylose를 얻을 수 있었다 (그림 4).


그림 4. 헤미셀룰로오스 분해 모듈 제작. A. 헤미셀룰로오스 분해 효소를 이용한 단당류 Xylose 생산. B. XlnA (Δ) 와 XynB (▲)의 생산 Western blotting 결과


헤미셀룰로오스 기반 세포 성장 시스템 구축


앞서 제작한 3가지 모듈을 하나의 시스템으로 합쳐서 제작하였다. 먼저 Xylose 이용 모듈과 Xylan 분해 모듈을 결합한 시스템과 여기에 Xylose 수송 모듈까지 결합한 시스템을 제작하여 각각의 성장 곡선을 확인하였다. 이는 최초로 코리네박테리움 글루타미쿰에서 헤미셀룰로오스를 단일 탄소원으로 이용하여 성장한 결과이다.


그림 5. 헤미셀룰로오스 기반 세포 성장 확인. A. 세포 성장곡선 B. 총 당류량 확인. ▲ Xylose 이용 모듈, Xylan 분해 모듈 ●Xylose 이용 모듈, Xylan 분해 모듈, Xylose 수송 모듈. ■ 공 플라스미드


통합형 공정을 통한 헤미셀룰로오스 기반 Lysine 생산


종적으로 제작한 통합형 공정 시스템이 유용한 바이오 화합물을 생산할 수 있는 지를 확인하기 위해서 Lysine 생산 균주에서 적용이 가능한지 확인하였다. 그 결과 세계 최초로 Lysine 생산을 헤미셀룰로오스 기반 통합형 공정으로 생산할 수 있었다.

그림 6. 헤미셀룰로오스 기반 Lysine 생산 A. 생장 곡선 및 lysine 생산 곡선 B. 전체 당류 분석 그래프


3. 연구의 성과 및 의의


현재 저가의 유가형성으로 인하여 바이오 에탄올에 대한 경제성이 많이 사라진 상황이지만 점차 의무 사용과 탄소 배출권의 현실화가 이루어지기 때문에 바이오매스 기반 연구는 계속 그 중요성이 사라지지 않고 있다. 그래서 본 연구는 이러한 흐름과 함께하고 있다. 기존의 공정을 대체하고 경제성 있고 효율적인 시스템을 위한 통합형 공정 균주를 제작하였다. 헤미셀룰로오스 중에 하나인 Xylan을 이용하는 시스템이지만 앞으로 미세조류 및 전분을 이용할 수 있는 시스템까지 적용하여 확장하고자 한다.


참고문헌
1. Yim, S. S., An, S. J., Choi, J. W., Ryu, A. J., and Jeong, K. J. ( 2014) High-level secretory production of recombinant single-chain variable fragment (scFv) in Corynebacterium glutamicum Appl. Microbiol. Biotechnol. 98, 273? 284, DOI: 10.1007/s00253-013-5315-x
2. Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., and Jeong, K. J. ( 2013) Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum Biotechnol. Bioeng. 110, 2959? 2969, DOI: 10.1002/bit.24954
3. Yim, S. S., Choi, J. W., Lee, R. J., Lee, Y. J., Lee, S. H., Kim, S. Y., and Jeong, K. J. ( 2016) Development of a new platform for enhanced secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum Biotechnol. Bioeng. 113, 163? 172, DOI: 10.1002/bit.25692
4. An, S. J., Yim, S. S., and Jeong, K. J. ( 2013) Development of a secretion system for the production of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum using the Porin B signal peptide Protein Expression Purif. 89, 251? 257, DOI: 10.1016/j.pep.2013.04.003






















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