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       당 감지 고감도 FRET 단백질 센서 및 소형 감지 장비 개발
               
       ISBC        2018.08.30 15:51        62
 

당 감지 고감도 FRET 단백질 센서 및 소형 감지 장비 개발


한국생명공학연구원 이승구 박사


Gam, J., Ha, J. S., Kim, H., Lee, D. H., Lee, J., & Lee, S. G. (2015). Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosensors and Bioelectronics, 72, 37-43.


Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., & Lee, S. G. (2015). A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst, 140(10), 3384-3389.


1. 연구배경


바이오센서란 생체감지물질과 신호변환기로 구성되어 생체내 분석하고자 하는 물질을 선택적으로 감지하여 인식 가능한 신호로 변환하는 장치이다. 이러한 바이오센서들 중 Fluorescence resonance energy transfer (FRET) 기반의 바이오센서는 칼슘이온이나 [1] 아미노산 등의 small molecule들을 분석하기 위해서 널리 개발되어 왔으며 그 대표적인 구성 예로는 ECFP (enhanced cyan fluorescent protein)와 EYFP (enhanced yellow fluorescent protein) 형광단백질들이 대장균 유래의 PBPs (periplasmic-binding proteins) 양 말단에 융합된 형태를 들 수 있다 (그림 1). FRET 생체센서의 작동 원리는 센서의 가운데 위치한 PBP이 당의 결합으로 인해 구조적 변화를 일으키게 되고, 그로 인해 양 말단에 위치한 두 형광단백질들 사이의 거리와 전위쌍극자방위의 변화에 의해 FRET의 발생이 달라지는데 이렇게 당의 결합으로 달라지는 FRET의 변화를 EYFP와 ECFP의 발광파장인 530nm와 480 nm의 비율을 측정함으로써 당의 정량적인 분석이 가능하다 (그림1). FRET의 이러한 특징과 PBP를 기질 결합 단백질로 이용하여 2002년 Stanford 대학교의 Frommer는 말토오스 측정용 FRET 바이오센서를 최초로 개발하였고 [2] 그 후 유사한 형태의 리보오스, 글루코스, 수크로스  측정용 센서 등이 지속적으로 개발되어 왔다 [3]. 그러나 FRET의 낮은 신호 감도는 지속적인 한계점으로 지적되어 왔고 링커 개량 등의 다양한 단백질 공학적 방법을 통한 신호 감도 향상 연구가 수행 되었다 [4]. 

그림 1. 실온에서 FRET의 리간드 (글루코스) 유무에 따른 형광 신호의 크기 변화


그러나 시료의 여기에너지는 방사광의 에너지에 비해 크게 작기 때문에 형광측정은 매우 민감도가 높은 시스템을 요구하며 특히 FRET의 경우 최종 에너지는 방사광의 에너지의 109배 이하이기 때문에 매우 정교한 감지 시스템이 필요하다. 또한 이러한 FRET 바이오센서는 실험실에서 일반적으로 사용되는 high-end 형광분석기로 측정이 가능하며 이러한 분석기는 광원으로 laser 또는 high pressure lamp를 사용하고 감지기는 높은 민감도의 부품을 사용하고 있어서 크기가 크고 가격이 비싸기 때문에 소규모 실험실이나 현장 진단형으로는 활용이 불가능 하다.


본 연구에서는 바이오센서를 구성하는 단백질이 특정 임계온도 이상에서 구조변화가 일어나는 현상을 연구하여 바이오센서의 낮은 신호감도를 15배 이상 증폭시켜 센서의 검출 능력을 획기적으로 증가시켰다. 또한 FRET 바이오센서의 고가 형광 측정 장비 의존성을 극복하기 위하여 파이버프로(주)와 공동으로 소형 휴대용 FRET감지 디바이스를 개발하였다.


2. 연구결과


본 연구에서는 FRET 최적 구동을 위한 임계온도를 찾아내어 적용함으로써 신호의 강도가 기존 FRET 센서에 비해 15배 이상 높아지는 결과를 얻었다. PEP로 사용된 Maltose Binding Protein (MBP)의 리간드 유무에 따른 구조 변화로 양 말단의 YFP와 CFP간 거리가 변화하면서 형광 신호가 달라지는데 이 리간드 결합단백질, MBP가 특정한 임계온도 이상에서 가역적 구조풀림(unfolding temperature)이 나타나고, 이 구조풀림의 수준이 리간드의 농도에 따라 달라지면서 신호의 크기도 달라지는 현상을 연구하였다. MBP기반 FRET 센서에 maltose를 처리 한 경우 60도 근처에서 형광이 급격히 줄어든 반면 maltose를 처리 하지 않은 경우 50도부터 형광이 줄어드는 현상을 연구하였다. 


그림 2. 임계온도에서 단백질 구조 풀림현상으로 인한 신호 증폭


이러한 현상을 바탕으로 온도 변화에 따라 표적 물질을 감지하는 FRET의 성능에 차이가 나는지 검증 작업을 수행했다. 그림 3-A의 경우 maltose의 농도를 10nM에서 10mM까지 변화하면서 반응하는 FRET 비율의 크기를 25도와 55도 각각에 대해서 측정하였고 기대한 대로 55도에서 높은 비율의 감도로 반응하는 FRET 센서의 결과를 얻을 수 있다. 마찬가지로 Allose, Arabinose, Glucose 등의 기질에 대해서도 각각의 FRET 센서가 55도에서 최대 17배 이상 높은 형광 크기를 보였다 (그림 3 B-D).


그림 3. 당 농도에 따른 FRET 바이오 센서의 형광 크기 비교


이러한 고감도 FRET센서 연구와 함께  FRET센서의 형광 검출에 이용되는 장비의 고가 laser나 lamp를 대체할 수 있는 최신 highly powered LED를 도입하여 기존의 형광분석기와 유사한 성능을 가지면서 저가인 소형 형광분석기를 개발 하였다. FRET 센서의 작은 형광신호의 크기에 대응하기 위하여 FRET 신호를 두 파장대역으로 나누어 각 대역내의 전체 신호를 읽는 방식을 선택하였는데 이 두 종류의 파장대역을 선정하는 경우에는 두 대역의 신호의 상대 크기 변화가 효과적으로 나타나도록 하는 것이 중요하며 효과적인 여기광의 파장대역도 선정해야 할 필요가 있다. 본 연구에서는 여기광의 흡수도와 이에 따른 형광 신호의 파장대역과의 간섭을 피하기 위하여 ECFP의 흡수 스펙트럼과 FRET 형광 스펙트럼을 조사 하였고 (그림 4) 이로부터 적절한 각 파장대역을 (1차 형광신호대역: 465 ~ 510 nm, 2차 형광신호대역 : 520 ~ 560 nm) 도출할 수 있었다.

그림 4. 1차 형광 단백질의 흡수 곡선과 FRET 신호의 스펙트럼


본 과제에서는 여기광의 파장을 405nm 대의 LED를 채용하여 제작하였으며 광원과 함께 휴대용 FRET 장비의 핵심인 광신호 검출계의 제작을 위해 비용 및 광량 감지의 효율성 최대화 한 실리콘 광검출기 (Si Photodiode)를 사용하였다. 실리콘 광검출기는 가시광선 영역의 빛을 검출하기 위하여 가장 널리 쓰이는 소자로서 350 nm~ 1100nm 의 넓은 파장대역에서 응답특성을 가지며 넓은 감지영역을 가지는 소자를 저가 (수 만원)로 구할 수 있다는 장점이 있다. 이렇게 선정된 광원 및 광검출기 등으로 구성된 광학계를 제작하였고 광학계에서 사용될 액상의 시료는 현재 형광측정 장치에서 널리 사용하고 있는 12.5 mm × 12.5 mm × 45 mm인 직육면체형태의 용기(cuvette, 큐벳)을 사용하였다 (그림 5).


그림 5. 소형 FRET 분석기, ㈜ 파이버프로와 공동 제작


제작된 FRET 진단장비의 정량성을 검증하기 위해 본 연구실에서 보유하고 있는 정제된 FRET 생체센서와 단색화장치 (monochromator)로 형광을 측정하는 Cary Eclipse (Varian, Australia)를 이용하여 결과를 비교 분석하였다. 분석에 사용한 생체FRET 센서는 allose와 arabinose, ribose, glucose를 각각 측정할 수 있는 센서들과, 보유 중인 센서 중 신호강도가 가장 우수한 maltose 센서 등을 사용 하였다. FRET 진단장비로 출력되는 수치는 두 발광량의 수치를 나눈 값인 530/480 nm ratio값으로 각 당에 대한 안정적인 S자형 정량곡선을 확보할 수 있었다 (그림 6). 특히 신호강도가 우수한 maltose 센서 뿐만 아니라, 신호강도가 비교적 낮은 allose와 arabinose, glucose, ribose 측정용 생체센서의 경우에도 안정적인 결과를 얻을 수 있었다.



그림 6. FRET 진단장비와 Cary Eclips를 이용한 allose (A)와 arabinose (B), glucose (C), ribose (D), maltose (E) 측정용 FRET 생체센서의 S자형 적정곡선 비교. ●; FRET 진단장비로 측정한 S자형 곡선, ○; Cary Eclips로 측정한 S자형 곡선.


3. 연구의 성과 및 의의


본 연구에서는 당 검출을 위한 고감도 FRET 센서와 이를 이용하여 쉽게 당의 함량을 측정할 수 있는 소형 분석기를 개발하였다. 추가적인 휴대 가능한 수준의 소형화와 저가화가 가능하다면 혈당 측정기 시장 진입 가능성이 충분하며 병원이나 연구소에서 사용되는 고가의 당 분석기기를 대체할 수 있는 가능성과 함께 소규모 실험실이나 전문가가 없는 환경에서 환자 스스로도 사용 진단이 가능한 현장진단 시스템으로 활용할 수 있을 것으로 기대한다. 또한 중소기업의 연구 개발 지원과 함께 지역경제 발전에도 기여할 수 있으며 당 검출뿐만 아니라 다양한 리간드에 결합하는 FRET 센서에 동일하게 적용 가능한 기술로 폭넓은 응용이 가능할 것으로 기대한다.


참고문헌
1. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., & Miyawaki, A. (2004). Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca2+ by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(29), 10554-10559.
2. Fehr, M., Frommer, W. B., & Lalonde, S. (2002). Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(15), 9846-9851.
3. Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., & Lee, S. G. (2007). Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Applied and environmental microbiology, 73(22), 7408-7414.
4. Takanaga, H., Chaudhuri, B., & Frommer, W. B. (2008). GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 1778(4), 1091-1099.







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