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       종양 혈관의 신생과 진행을 효율적으로 억제하는 새로운 단백질의약품 후보물질 (VEGF-Grab)의 개발
               
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종양 혈관의 신생과 진행을 효율적으로 억제하는 새로운 단백질의약품 후보물질 (VEGF-Grab)의 개발


한국과학기술원 김호민 교수


Novel Glycosylated VEGF Decoy Receptor Fusion Protein, VEGF-Grab, Efficiently Suppresses Tumor Angiogenesis and Progression / Molecular Cancer Therapeutics. 2015 Feb;14(2):470-9


1. 연구배경


혈관신생은 정상적인 신체의 발달, 상처회복, 월경 등 여러 생리적 현상에서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, 이는 생체 내 촉진인자(Activator)와 억제인자(Inhibitor)의 균형에 의하여 매우 엄격하게 조절되고 있다 (Carmeliet, 2005). 특히 혈관내피세포 성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor Family, VEGF-A, VEGF-B 그리고 PlGF)는 생리적 혈관신생 기전에 매우 중요한 대표적인 촉진인자이다. 하지만, 종양의 성장과 전이, 나이관련 황반변성, 당뇨망막병증, 정맥폐쇄연관 황반부종, 미숙아망막병증, 류마티스 관절염 등의 병적 상황에서 VEGF 발현 조절이 붕괴된 경우, 비정상적인 혈관신생을 유도하여 혈관 투과성 증가에 따른 조직 부종, 출혈, 치유과정에서 섬유화에 따른 반흔 형성을 야기시켜 신체 기관의 기능을 저하시킨다. 1971년 종양외과 의사였던 Judah Folkman박사가 종양의 성장이 혈관 신생에 의존적일 것이라는 가설이 최초로 제기된 이후 (Folkman et al., 1971), 현재까지 많은 항암표적치료 연구가 혈관신생억제제 개발에 초점을 두어왔다. 특히 VEGF-A 작용을 효과적으로 저해하는 대표적인 글로벌 의약품인 Avastin, Leucentis 이 많은 각광을 받고 있다 (Ferrara and Alitalo, 1999). 또한 최근 PIGF의 경우 VEGF-A에 비해서 생리적 상황에서는 혈관 신생을 조절하는 비중이 크지 않으나, VEGFR-1에 결합하여 병적 혈관신생의 필수적인 조절인자임이 확인되었기에 새로운 질병치료 타겟단백질로 인식되고 있다 (Fischer et al., 2007).


VEGF-A에만 결합하는 항체 의약품인 Avastin, Leucentis 와 달리 2012년 FDA에 승인을 받아  시장에 출시된 Zaltrap의 경우, VEGF-A 뿐 아니라 PlGF, VEGF-B를 모두 결합할 수 있는 VEGFR의 도메인 (VEGFR1 D2-VEGFR2D3-Fc)으로 구성되어 있으며, 이에 따라 병리적 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있었다. (Holash et al., 2002). 하지만 VEGFR1이 가진 리간드에 대한 강한 결합력이 일부 감소되었고, 또한 체내 반감기가 기존 약물보다 크게 증가되지는 못하였다. 본 연구에서는 세 리간드 (VEGF-A, VEGF-B 그리고 PIGF)에 대해 강력한 결합력을 유지하기 위해 VEGFR1의 D2-D3 도메인을 그대로 활용하면서도 부작용이 없으며, 당쇄화 도입을 통하여 체내 반감기가 늘어난 바이오베터 (VEGF-Grab)를 개발하였고, 이를 활용한 항암치료 가능성을 다각도로 검증하였다.


2. 연구결과


모델링한 VEGFR1과 VEGF 복합체의 3차원 구조를 바탕으로 VEGF-A와 PIGF에 대한 결합력과 전체적인 구조에는 영향을 주지 않을 것으로 생각되는 VEGFR1의 D3 loop부분의 양전하성 아미노산 세 부분 (a,b,c)을 선정하여 (그림1 A, B) 음전하성 특히 당쇄화가 가능한 아미노산 (Ser, Thr, or Ans)으로 치환한 VEGF-Grab 플랫폼을 설계하였다. 이들 중 VEGF-Grab1과 VEGF-Grab3가 CHO 세포에서 원활히 생산됨을 확인하였고 (그림1 D), In vitro, 세포수준, 항암마우스모델 등을 활용하여 병리적 상황에서 VEGF-Grab의 혈관생성 억제효능을 검증하였다. 


그림1. VEGF-Grab 플랫폼 설계전략. VEGF/VEGFR의 3차원 구조(A,B), VEGF-Grab의 설계모식도(C),

CHO세포에서 생산 및 정재(D)


VEGF-Grab1과 VEGF-Grab3의 경우, VEGF-A에 의해 활성화되는 여러 세포반응 (VEGFR 인산화 (그림2 A, B, C), 세포 Survival (그림2 D), 세포 Migration (그림2 E, F), Tube Formation (그림2 G, H) 등)을 효과적으로 억제하는 것이 확인되었다. 특히 VEGF-Grab의 경우 가장 최근 출시된 표준치료 약물인 Zaltrap 보다 VEGF-A와 PIGF에 대한 결합력이 훨씬 강한 것 (그림2 I, J. K)을 확인할 수 있었다.

그림2. VEGF-Grab의 In vitro 활성 및 세포수준 효능 검증


상기에서 관찰된 결과들의 생체 내 효능을 관찰하기 위해 종양모델을 제작하여 VEGF-Grab의 In vivo 효능을 검증하였다. 종양모델은 두 종류를 이용하였는데 1) 암세포를 피부에 이식하는 고형암 모델과 2) 유전적 변이에 의해 노화에 따라 암이 생성되는 자발적 유방암 모델 (PyMT transgenic 암컷 생쥐)을 이용하였다. 약물로는 약력학 가장 좋은 결과를 나타내었던 VEGF-Grab3를 선정하였으며, 종양모델에서의 효능은 표준 치료약물로 사용되고 있는 Zaltrap와 비교 분석하였다. 고형암 모델에서는 대조군에 비해 VEGF-Grab3 투여군에서 종양성장이 현저히 감소하였고, 종양 주변 혈관 역시 감소함이 확인되었다 (그림3 A, B, C). 또한 종양 내 침투한 Myeloid Cell 역시 감소하였고, 림프절을 통해 전이된 암세포 역시 현저히 감소한 것을 확인하였다 (그림3 E). 자발적 유방암 발생모델에 VEGF-Grab3를 투여한 군에서는 암 덩어리의 크기 자체도 감소하였고 (그림3 H), 암 내부의 혈관 역시 현저하게 감소하였으며 (그림3 G), 초기 carcinoma lesion이 잘 보존되는 것으로 보아 (그림3 F) axillary 림프절로의 전이 역시 현저하게 감소시킴으로써 (그림3 I) 암세포의 전이능력 또한 강력하게 저해하는 것을 확인 할 수 있었다. 


그림3. 종양모델 (고형암, 자발적 유방암 발생 모델) 마우스에서 항암효과 확인


Mass spectroscopy를 활용하여 VEGF-Grab의 당쇄화를 분석한 결과 초기 개발의도에서 목표한대로 돌연변이 도입부에 당쇄화가 잘 일어나 있음을 확인할 수 있었다 (그림4). 당쇄화가 도입된 VEGF-Grab의 경우 단백질의 등전점이 확연히 감소하였고, 이에 따라 Extracellular Matrix의 음전하에 결합하는 능력 또한 현저히 감소됨을 확인하였다. 이는 체내 반감기를 2배 가까이 늘려주는 효과로 이어졌고 (그림4 A-C), 특히 VEGF-Grab을 이용한 항암모델에 이틀 간격으로 투여한지 15일 되는 시점에 투약을 중지한 후, 혈관신생 재발 여부를 검증하는 실험에서 기존 약물인 Zaltrap에 비해 혈관신생 억제 효과가 훨씬 더 오래 지속되고 있음을 확인할 수 있었다 (그림 5).


그림 4. VEGF-Grab 당쇄화 도입에 따른 체내 반감기 증가



그림 5. VEGF-Grab의 우월한 체내 약효 지속성 검증


3. 연구의 성과 및 의의


본 연구진은 혈관신생의 주요 조절인자인 VEGR/VEGFR1 복합체 3차구조에 기반한 단백질 설계를 통하여, 약효 및 체내지속성이 높은 단백질 신약후보물질 VEGF-Grab을 개발하였으며, 항암모델에서 기존의 약물보다 더 좋은 치료효과를 보여주었고, 이러한 발견은 VEGF-Grab이 Anti-angiogenic 항암치료를 위한 유망한 선도물질임을 시사하고 있다. 특히 본 연구는 암 관련 저명 국제 학술지인 Molecular Cancer Therapeutics 2014년 2월호에 Highlight of This Issue로 소개되었으며, PCT 출원을 통해 향후 기술이전을 위한 지적재산권도 확보하였다. 중심 시력 유지에 중요한 황반부위에 비정상 신생혈관이 과도하게 형성되어 실명에 이르게 하는 노인실명의 제 1원인 중 하나인 노인성 황반변성 치료에도 VEGF-Grab의 적응증을 확대하기 위하여, 향후 망막혈관질환 동물모델을 신규로 구축하고 VEGF-Grab을 투여하여 그 치료효능을 관찰하는 실험을 진행할 것이다.


최종적으로 글로벌 단백질의약품으로 개발되기 위하여서는 생산량 증대, 임상시험에서의 안정성과 효능검증 등 넘어야 산들이 여전히 존재한다. 하지만, 바이오합성연구단의 다른 연구팀들과 공동연구를 통하여 합성생물학 기반의 엔지니어링이 된 신개념 CHO세포주를 활용한다면, 단백질의약품 생산량 증대를 위한 공정개발 연구도 가속화할 수 있을 것으로 기대한다. 또한 KAIST 의과학대학원에 있는 임상경험이 있으면서도, 기초연구를 우수하게 수행할 수 있는 잘 훈련된 MD/PhD 과정의 학생들과 함께 임상시험 전략을 구상함으로써, 효율적이면서도 성공적인 임상시험을 할 수 있을 것으로 기대한다. 현재 대장암, 난소암, 유방암등 다양한 암치료에 활용되는 Avastin의 경우 매년 최소 10억달러 이상의 신규시장을 창출하고 있으며, 2010-2016년 의약품별 매출추이를 살펴볼 때, 항체의약품 및 단백질의약품 시장은 빠른 성장률을 보이며 2016년 전체 250억달러 이상의 매출액을 기록할 것으로 예측된다. 따라서 본 연구가 성공적으로 수행될 경우 바이오시밀러 개발에 집중하고 있는 국내 제약시장에도 많은 파급효과를 가져올 것이며, 축적된 기술력은 새로운 신규 단백질의약품 개발에 활용됨으로써 선순환 형태의 발전으로 이러질 수 있을 것이다.


참고문헌
1. Carmeliet,P.(2005).Angiogenesisinlife,diseaseandmedicine.Nature 438, 932-936.
2. Ferrara, N., and Alitalo, K. (1999). Clinical applications of angiogenic growth factors and their inhibitors. Nature medicine 5, 1359-1364.
3. Fischer, C., Jonckx, B., Mazzone, M., Zacchigna, S., Loges, S., Pattarini, L., Chorianopoulos, E., Liesenborghs, L., Koch, M., De Mol, M., et al. (2007). Anti-PlGF inhibits growth of VEGF(R)-inhibitor-resistant tumors without affecting healthy vessels. Cell 131, 463-475.
4. Folkman, J., Merler, E., Abernathy, C., and Williams, G. (1971). Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. The Journal of experimental medicine 133, 275-288.
5. Holash, J., Davis, S., Papadopoulos, N., Croll, S.D., Ho, L., Russell, M., Boland, P., Leidich, R., Hylton, D., Burova, E., et al. (2002). VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 11393-11398.








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