¿ÞÂÊ ¸Þ´º ŸÀÌÆ² À̹ÌÁö
Áֿ伺°ú

Home < Áֿ伺°ú < Áֿ伺°ú

       Æ÷À¯¼¼Æ÷¿¡¼­ CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡¿Í À¯ÀüÀÚ È¸·Î °³¹ß
               
       ISBC        2018.08.30 15:24        853
 

Æ÷À¯¼¼Æ÷¿¡¼­ CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡¿Í À¯ÀüÀÚ È¸·Î °³¹ß


KAIST ¹ÙÀÌ¿ÀÀ¶ÇÕ¿¬±¸¼Ò ÇãÁøÇà ¿¬±¸¿ø


Kiani, S., Beal, J., Ebrahimkhani, M. R., Huh, J., Hall, R. N., Xie, Z., Li, Y., Weiss, R. CRISPR transcriptional repression devices and layered circuits in mammalian cells. Nature Methods, 11, 723-726 (2014).


1. ¿¬±¸¹è°æ


À¯ÀüÀÚ È¸·Î °³¹ßÀº »ì¾ÆÀÖ´Â ¼¼Æ÷ÀÇ ±Ùº»ÀûÀÎ »ý¹°Çп¡ ´ëÇÑ ÅëÂû·Â°ú ÀÇ·á¿¡¼­ºÎÅÍ »ê¾÷±îÁö À̸£´Â ¸¹Àº ¹®Á¦¿¡ ´ëÇÑ ÀáÀçÀûÀÎ ÇØ°á ¹æ¾ÈÀ» Á¦°øÇÑ´Ù1,2. ÀÌ·¯ÇÑ Á¤±³ÇÑ À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ È¿À²ÀûÀ¸·Î °³¹ßÇϱâ À§Çؼ­´Â »õ·Ó°í ¿¹Ãø°¡´ÉÇÑ ÇൿÀ» ±¸ÇöÇÒ ¼ö ÀÖ°í ¿©·¯ Á¶°Ç¿¡¼­ ¿¬°á ÇÒ ¼ö ÀÖ´Â Á¦¾îÀåÄ¡ ¶óÀ̺귯¸®°¡ ÇÊ¿ä·Î ÇÏ´Ù. ÇÕ¼º »ý¹°Çп¡¼­ Á¦¾î ÀåÄ¡¶õinputÀÇ Á¤º¸¸¦ ÇÁ·Î¼¼½ºÇÏ¿© output°ú ¿¬°á ½ÃŰ´Â »ýÈ­ÇÐÀûÀÎ »óÈ£ÀÛ¿ëÀ¸·Î Å©°Ô Á¤ÀÇ ³»¸°´Ù1,3. ¿ì¸®´Â inputÀ» ¾î´À ÀÎÀÚÀÇ ¹ßÇöÀ¸·Î ÀÌ¿ëÇϰí, ±× ÀÎÀÚ°¡ outputÀÇ Àü»ç¸¦ Á¶ÀýÇÏ´Â Àü»ç ÀåÄ¡¸¦ ¿¬±¸ÇÏ¿´´Ù. ƯÈ÷ Àü»ç Ȱ¼ºÀÎÀÚµé°ú´Â ´Þ¸® Àü»ç ¾ïÁ¦ ´Ü¹éÁúµéÀº À̷лó ¾î´À ¿¬»ê ȸ·Î³ª ¸¸µé ¼ö Àֱ⠶§¹®¿¡ Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡¿¡ ÃÊÁ¡À» ¸ÂÃß¾î ¿Ô´Ù4,5. ÇöÀç±îÁö ¹Ì»ý¹°¿¡¼­µç µ¿¹°¼¼Æ÷¿¡¼­µç Å©°í º¹ÀâÇÑ È¸·Î¸¦ ¸¸µé ¼ö ¾ø¾ú´øµ¥¿¡´Â ³¢°í ¸ÂÃß¾î ÀÛµ¿ÇÏ´Â À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ ¸¸µé ¸¸Å­ÀÇ ÃæºÐÇÑ ¼ýÀÚÀÇ orthogonalÇÑ Àü»çÀÎÀÚ¿Í ±×ÀÇ ÇÁ·Î¸ðÅÍ Â¦ÀÌ ¾ø´Ù´Â °ÍÀ̾ú´Ù3.


ÀÌ ¹®Á¦¸¦ ÇØ°áÇϱâ À§ÇØ zinc finger ´Ü¹éÁúÀ̳ª transcription activator-like effector (TALE) ´Ü¹éÁúÀ» ÀÌ¿ëÇÑ ³ë·ÂÀÌ ÀÖÁö¸¸, º¹ÀâÇÑ DNA Á¶¸³ ¹æ¹ý°ú6,7,8 ÀÌµé ´Ü¹éÁú¿¡ ÀÇÇØ Ÿ°Ù ÇÁ·Î¸ðÅÍÀÇ epigenetic º¯Çü¿¡ ÀÇÇØ ÀÀ´ä ¼Óµµ°¡ ´Ê¾îÁö´Â ¹®Á¦¸¦ °¡Áö°í ÀÖ´Ù9. ÀÌ ¹Û¿¡ ÃÖ±Ù    Streptococcus pyogenes CRISPR-Cas immune systmeÀÇ Cas9 ´Ü¹éÁúÀ» RNA-guided °Ô³ð ÆíÁý°ú À¯ÀüÀÚ Á¶Àý¿¡ Àû¿ë½ÃŲ ¿¬±¸µéÀÌ ¹ßÇ¥µÇ¾ú´Âµ¥8,10,11,12,13, ÀÌ ¸ÞÄ¿´ÏÁòÀÌ À¯ÀüÀÚ Á¶Àý ÀåÄ¡ÀÇ ¶óÀ̺귯¸®¸¦ ¸¸µé ¶§ À¯¿ëÇÑ ÀÌÀ¯´Â ¾î´À DNA ¼­¿­À̵çÁö ±×¿¡ ¸Â°Ô small guide RNA (gRNA)ÀÇ À¯ÀüÀÚ ¼­¿­À» ¹Ù²Ù¾îÁÖ¸é ½±°Ô Cas9À¸·Î ±× DNA ¼­¿­À» Àß¶ó ³¾ ¼ö Àֱ⠶§¹®ÀÌ´Ù6. ¶ÇÇÑ catalytically inactive Cas9 (Cas9m)À» ÀÌ¿ëÇØ Àü»ç¸¦ ¾ïÁ¦ÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù8,9,10,11. ±×·¯¹Ç·Î ¿ì¸®´Â ÀÌ ¸ÞÄÉ´ÏÁòÀ» ÀÌ¿ëÇØ Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡¿Í À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ ¸¸µé¾î º¸¾Ò´Ù. ±¸Ã¼ÀûÀ¸·ÎRNA polymerase type II (RNA Pol II)¿Í RNA Pol III¸¦ »ç¿ëÇÏ¿© Àΰ£ ¼¼Æ÷¿¡¼­ gRNAsÀÇ ÅëÁ¦µÈ Àü»ç ¹æ¹ýÀ» °í¾ÈÇÏ¿´°í, CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡´Â ³ôÀº on/off ºñÀ²À» °¡Áø À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ Á¶¸³ÇÒ ¼ö ÀÖ´Ù´Â °ÍÀ» º¸¿© ÁÖ¾ú´Ù.


2. ¿¬±¸°á°ú


Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡´Â Cas9m°ú gRNA·Î ±¸¼ºµÇ¾î Àִµ¥,  gRNA°¡ ƯÁ¤ÇÑ ÇÁ·Î¸ðÅ͸¦ Ÿ°ÙÆÃÇÏ°Ô ÇÔÀ¸·Î½á Cas9mÀÌ ±× ÇÁ·Î¸ðÅÍÀÇ Àü»ç ±â´ÉÀ» ¾ïÁ¦ ½ÃŰ´Â ¸ÞÄÉ´ÏÁòÀÌ´Ù. gRNA¸¦ Àü»çÇϱâ À§ÇØ ÀϹÝÀûÀ¸·Î RNA Pol III¸¦ »ç¿ëÇϴµ¥ U6 ÇÁ·Î¸ðÅͰ¡ ÀÚÁÖ ¾²ÀδÙ. ÀÌ ºÎǰµéÀ» ÀÌ¿ëÇØ layeredµÈ À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ ¸¸µé°í cascade¸¦ ½ÇÇèÇÏ¿´´Ù (±×¸² 1). ±×·± ´ÙÀ½,  intronÀ» Áö´Ñ ´Ü¹éÁúÀÌ ¹ßÇöµÉ ¶§ intronÀÌ spliceµÇ´Â °ÍÀ» ÀÌ¿ëÇÏ¿© intronÀÚ¸®¿¡ gRNA¸¦ ³ÖÀ½À¸·Î½á À¯ÀüÀÚ¸¦ Àü»çÇÒ¶§ ¾²ÀÌ´Â Pol II¸¦ ÀÌ¿ëÇÏ¿©¼­µµ gRNA¸¦ Àü»çÇÒ ¼ö ÀÖ°Ô ÇÏ¿´´Ù. ÀÌ ¹æ¹ýÀÇ ÀåÁ¡Àº ±âÁ¸ÀÇ À¯ÀüÀÚ È¸·Î¿¡ ¸¹ÀÌ »ç¿ëµÇ´Â GAL4VP16À̳ª TRE ½Ã½ºÅÛ°ú °°Àº À¯ÀüÀÚ Á¶Àý ºÎǰµéÀ» ÀÌ¿ëÇÏ¿© gRNAÀÇ Àü»ç¸¦ Á¶ÀýÇÒ ¼ö Àֱ⠶§¹®ÀÌ´Ù. DoxycyclineÀ¸·Î Àü»çµÇ´Â Á¤µµ¸¦ Á¶ÀýÇÒ ¼ö ÀÖ´Â TRE ÇÁ·Î¸ðÅ͸¦ ´õÇÏ¿© CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡¿Í À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ ¸¸µé°í cascade¸¦ ½ÇÇèÇÏ¿´´Ù (±×¸² 2).



±×¸² 1: RNA Pol III U6 ÇÁ·Î¸ðÅ͸¦ ÀÌ¿ëÇÑ CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡¿Í À¯ÀüÀÚ È¸·ÎÀÇ ¼³°è ¹× ½ÇÇè ºÐ¼®. (a) CRP ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡ÀÇ È¸·Îµµ. CRa-U6´Â gRNA-bÀÇ Àü»ç¸¦ Á¶ÀýÇϰí, gRNA-b´Â EYFP outputÀÇ Àü»ç¸¦ Á¶ÀýÇÑ´Ù. (b) HEK293¼¼Æ÷¿¡¼­ ¼¼°¡Áö ¹öÀüÀÇCRa-U6 ÇÁ·Î¸ðÅÍ·Î Á¶ÀýµÇ´Â gRNA-b. (C) CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡ cascadeÀÇ È¸·Îµµ. U6¿¡ ÀÇÇØ Á¶ÀýµÇ´Â gRNA-a´Â CRa-U6¿¡ ÀÇÇØ Á¶ÀýµÇ´Â gRNA-b¸¦ Á¶ÀýÇϰí, ÀÌ gRNA-b´Â EYFP ouputÀÇ Àü»ç¸¦ Á¶ÀýÇÑ´Ù. (D) CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡ cascadeÀÇ ½ÃÇè.




±×¸² 2: RNA Pol II¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡¿Í À¯ÀüÀÚ È¸·ÎÀÇ ¼³°è ¹× ½ÇÇè ºÐ¼®. (a) TRE ÇÁ·Î¸ðÅͿ͠ doxycycline (Dox)¿¡ ÀÇÇØ ÀÛµ¿µÇ´Â gRNA-a Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡. (b) TRE ÇÁ·Î¸ðÅÍ¿¡ ÀÇÇØ Á¶ÀýµÇ´Â mKate°ú igRNA¸¦ ¹ßÇöÇÏ´Â igRNA Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡. (C) Dox¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ reversibleÇÑ Àü»ç ¾ïÁ¦ ½ÇÇè ºÐ¼®. (D) igRNA¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ cascades ½ÇÇè.


3. ¿¬±¸ÀÇ ¼º°ú ¹× ÀÇÀÇ


Zinc finger ´Ü¹éÁúÀ̳ª TALE ´Ü¹éÁúÀ» ÀÌ¿ëÇÑ Àü»ç Á¶Àý ÀåÄ¡¿¡ ºñÇØ CRISPR¸¦ ÀÌ¿ëÇÑ Àü»ç Á¶Àý ÀåÄ¡´Â À¯ÀüÀÚ È¸·Î¿¡ layer¸¦ Çϳª Çϳª ´õÇÒ ¶§ ¸¶´Ù À¯ÀüÀÚ È¸·Î ÀÚü¿¡ ´õÇØÁö´Â ÃÑ DNAÅ©±â°¡ À۱⠶§¹®¿¡ Å©°í º¹ÀâÇÑ À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ ¸¸µé¶§ À¯¿ëÇÏ´Ù. ÀÌ´Â °°Àº topology¸¦ °¡Áø À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ ÈξÀ ÀÛÀº Å©±âÀÇ DNA¿¡  ÀÎÄÚµù ÇÒ ¼ö ÀÖÀ¸¸ç ¸Å¿ì º¹ÀâÇÑ È¸·Î¸¦ size limitationÀÌ ÀÖ´Â ¿î¹Ýü¿¡ ´ãÀ»¼ö ÀÖÀ½À» ÀǹÌÇÑ´Ù. ¶ÇÇÑ CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡´Â RNA interference¿¡ ÀÇÇÑ À¯ÀüÀÚ Á¶Àý ¸ÞÄÉ´ÏÁò°ú Àß ÅëÇÕ µÉ°ÍÀ¸·Î ¿¹»óµÇ¾î ¼¼Æ÷ÀÇ »óųª ÇÁ·ÎÆÄÀÏÀ» ±¸º°ÇÒ ¼ö ÀÖ´Â À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ ¸¸µé ¶§ Áß¿äÇÏ°Ô ¾²ÀϰÍÀÌ´Ù. ¶ÇÇÑ orthogonal Cas9 ´Ü¹éÁúµéÀ» ÀÌ¿ëÇϸé14 ÇÑ Ãþ ´õ º¹ÀâÇÑ À¯ÀüÀÚ È¸·Î¸¦ ¸¸µé ¼ö ÀÖÀ»°ÍÀÌ´Ù. ¸¶Áö¸·À¸·Î, gRNA¿Í ±×¿¡ ¸Â´Â ÇÁ·Î¸ðÅ͸¦ºü¸£°í ½±°Ô Ãß°¡·Î ¸¸µé ¼ö Àֱ⠶§¹®¿¡ ºü¸¥ ½Ã°£¾È¿¡ Å« Á¦¾îÀåÄ¡ ¶óÀ̺귯¸®¸¦ ¸¸µé°í  ½ÇÇè ¹× ÃÖÀûÈ­°¡ °¡´ÉÇÏ´Ù. µû¶ó¼­ ¿ì¸®°¡ °³¹ßÇÑ Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡´Â ÀÌ·¯ÇÑ ÀåÁ¡µéÀ» ¹ÙÅÁÀ¸·Î Àΰ£ ¼¼Æ÷¿¡¼­ ¸¹Àº ¾îÇø®ÄÉÀ̼ǿ¡ Àû¿ëµÉ ¼ö ÀÖÀ»°ÍÀÌ´Ù.


Âü°í¹®Çå
1. E. Andrianantoandro, S. Basu, D. K. Karig & Weiss, R. Mol. Systems Biol. 2, 0028 (2006).
2. Ruder, W.C., Lu, T. & Collins, J.J. Science 333, 1248–1252(2011).
3. Slusarczyk, A.L., Lin, A. & Weiss, R. Nat. Rev. Genet. 13,406–420 (2012).
4. Bird, J. Engineering Mathematics 532 (Elsevier Science,2007).
5. Peirce, C.S. Collected Papers of Charles Sanders Peirce vol.4, 12–20 (Harvard University Press, 1933).
6. Farzadfard, F., Perli, S.D. & Lu, T.K. ACS Synth. Biol. 2,604–613 (2013).
7. Khalil, A.S. et al. Cell 150, 647–658 (2012).
8. Garg, A. et al. Nucleic Acids Res. 40, 7584–7595 (2012).
9. Kramer, B.P., Fischer, C. & Fussenegger, M. Biotechnol. Bioeng. 87, 478–484 (2004).
10. Stanton, B.C. et al. Nat. Chem. Biol. 10, 99–105 (2014).
11. Fu, Y. et al. Nat. Biotechnol. 31, 822–826 (2013).
12. Mali, P. et al. Science 339, 823–826 (2013).
13. Qi, L.S. et al. Cell 152, 1173–1183 (2013).
14. Esvelt, K.M. et al. Nat. Methods 10, 1116–1121 (2013).







Total:45 page:(3/2)
29 Á¤º¸ ISBC »ý¹° ģȭÀûÀÎ Fe2O3 ¿äÅ©½© ÀÔÀÚÀÇ ´ë±Ô¸ð ¿¡¾î.. 18.09.04 1206
28 Á¤º¸ ISBC Ç×»ýÁ¦ »ý»ê ÃÖÀûÈ­¸¦ À§ÇÑ ¹æ¼±±Õ À¯ÀüÀû µµ±¸ .. 18.09.04 998
27 Á¤º¸ ISBC Àúºñ¿ë °íÈ¿À² ¸ÂÃãÇü ¹Ì»ý¹° °Ë»ö Ç÷§Æû °³¹ß 18.09.04 3279
26 Á¤º¸ ISBC ÄÚ¸®³×¹ÚÅ׸®¿ò ±Û·çŸ¹ÌÄñ¿¡¼­ Çì¹Ì¼¿·ê·Î¿À½º .. 18.09.04 1265
25 Á¤º¸ ISBC Ç×»ýÁ¦ »ýÇÕ¼º ¹æ¼±±Õ À¯ÀüÀÚ ¹ßÇö Á¶Àý ±Ô¸í 18.09.04 1143
24 Á¤º¸ ISBC NK cell¿¡¼­ NF-¥êBÀÇ ´Ü°èÀû ÀλêÈ­¿Í Á¶ÀýÀ» Åë.. 18.09.04 1355
23 Á¤º¸ ISBC Cross linker¸¦ ÅëÇØ ¾ÈÁ¤È­µÇ´Â À¶ÇÕ ¾ËÆÄÇ︯½º.. 18.09.04 1579
22 Á¤º¸ ISBC Àü»çü ºÐ¼®°ú DNA-free CRISPR ½Ã½ºÅÛÀ» ÀÌ¿ëÇÑ .. 18.09.04 1701
21 Á¤º¸ ISBC Antisense RNA ±â¹Ý Á¤Á·¼öÀÎ½Ä Â÷´ÜÈ¿¼Ò °í¼Ó´Ù.. 18.08.30 1096
20 Á¤º¸ ISBC À¯ÀüÀÚ ¹ßÇö ÆÐÅÏÀ» ÀÌ¿ëÇÑ ¾à¹°Ç¥ÀûÀûÇÕ¼ºÀÇ °³.. 18.08.30 971
19 Á¤º¸ ISBC ´ç °¨Áö °í°¨µµ FRET ´Ü¹éÁú ¼¾¼­ ¹× ¼ÒÇü °¨Áö .. 18.08.30 1679
18 Á¤º¸ ISBC ´ëÀå±Õ ÃÑÀ¯Àüü³»ÀÇ ArgR Àü»çÀÎÀÚ¿Í DNA °áÇÕü.. 18.08.30 1125
17 Á¤º¸ ISBC Á¾¾ç Ç÷°üÀÇ ½Å»ý°ú ÁøÇàÀ» È¿À²ÀûÀ¸·Î ¾ïÁ¦ÇÏ´Â .. 18.08.30 1533
16 Á¤º¸ ISBC Æ÷À¯¼¼Æ÷¿¡¼­ CRISPR Àü»ç ¾ïÁ¦ ÀåÄ¡¿Í À¯ÀüÀÚ È¸.. 18.08.30 854
15 Á¤º¸ ISBC ¾ËÄÚ¿Ã ºÐÇØÈ¿¼Ò III (Alcohol Dehydrogenase III.. 18.08.30 1306
14 Á¤º¸ ISBC FACS ±â¹ÝÀÇ ÇÕ¼º Àΰ£ Ç×ü Ãʰí¼Ó ¹ß±¼ ½Ã½ºÅÛ .. 18.08.30 1628
[1] [2] [3]