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       FACS 기반의 합성 인간 항체 초고속 발굴 시스템 구축
               
       ISBC        2018.08.30 15:07        2413
 

FACS 기반의 합성 인간 항체 초고속 발굴 시스템 구축


한국과학기술원 정기준 교수


Rapid Isolation of Antibody from a Synthetic Human Antibody Library by Repeated Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) / PLOS One [Accepted]


1. 연구배경


인체 내에서 항체는 외부로부터 들어오는 항원과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거하는 면역단백질이며, 항체의 이러한 성질을 이용하면 면역세포 신호전달 체계에 관여하는 단백질 항원, 암세포 표면에서 발현되는 표지인자, 또는 유해 바이러스 표면의 표지인자 등을 표적으로 하는 단클론항체를 제작하여 질병의 치료 혹은 진단에 이용할 수 있다 [1, 2]. 원하는 항원을 표적으로 하는 단클론항체의 효과적인 개발을 위해 박테리오파지를 이용한 파지 디스플레이 시스템, 대장균 혹은 효모의 세포 표면 디스플레이 시스템, 그리고 리보솜 디스플레이 시스템 등등 다양한 단백질공학 기술들이 개발되어 이용되어 왔다 [3, 4]. 하지만 현재까지 개발된 기술들의 대부분은 라이브러리로부터 원하는 항체를 발굴하기 위해 라이브러리의 반복된 스크리닝을 필요로 하기 때문에 항체 발굴에는 최소 수 일에서 수 주까지 시간이 걸리게 되고, 바이러스를 통해 급속도로 번지는 인간 또는 가축 질병에 대해서는 적시에 대처를 하기에 매우 어렵다는 단점이 있다. 이에 본 연구진은 항체 라이브러리 스크리닝에 소요되는 시간을 단축하고자 본 연구를 시작하게 되었다 [5].


2. 연구결과


기존 미생물을 통한 항체 라이브러리 스크리닝은 보통 다음과 같은 단계로 수행이 된다 (그림 1). i) 라이브러리 세포의 배양 단계; ii) 형광염료가 붙은 목표 항원과 라이브러리 세포의 반응 단계; iii) 형광활성 세포 분류기 (FACS)를 통한 스크리닝 단계; iv) 스크리닝을 통해 분류된 라이브러리 세포의 재생; v) 최종 항체가 얻어질 때까지 i 단계부터 반복[6].


그림 1. 항체 라이브러리의 새로운 FACS 기반 스크리닝 전략 모식도.


이 과정 중에서 가장 많은 시간이 소요되는 과정은 iv 단계의 라이브러리 세포의 재생 과정인데, 현재 널리 사용되는 대부분의 스크리닝 전략에서는 일반적으로 FACS 스크리닝 이후에 분류된 세포를 다시 키우거나 (최소 하루 소요), 분류된 세포가 가진 항체 유전자를 얻어서 다시 클로닝하는 (최소 3~4일 소요) 방법으로 수행하기 때문이다. 이러한 문제를 해결하고자 본 연구진은 분류된 라이브러리 세포를 재생 과정 없이 연속해서 FACS 스크리닝을 반복하는 전략으로 단 하루에 모든 FACS 스크리닝 과정을 끝낼 수 있도록 실험을 수행하였고 (그림 1), 그 결과 H1N1 인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스 그리고 구제역 바이러스의 표면 항원들에 대해서 활성이 매우 높은 (KD=~수십 nM) 항체들을 각각 단 하루의 FACS 스크리닝을 통해서 발굴할 수 있었다 (그림 2). 특히 구제역 바이러스 표면 항원인 VP1에 대해서 발굴한 항체는 실제 구제역 바이러스에 대해서도 큰 활성을 보여주었다 (그림 3).


그림 2. H1N1 인플루엔자 바이러스의 N1 표면 항원에 대한 항체 스크리닝. (A) FACS 스크리닝 데이터. 오리지널 라이브러리, 1st sorted라이브러리, 2nd sorted라이브러리, 3rd sorted라이브러리 그리고 4th sorted라이브러리는 빨간색, 주황색, 초록색, 파란색 그리고 보라색 선으로 표시되었다. (B) 면역흡착반응검사를 통한 최종적으로 분류된 라이브러리의 개별 클론 분석. 검은색 막대는 Negative control의 BSA가 코팅된 well에서의 값, 회색 막대는 GST에 융합된 N1 표면 항원이 코팅된 well에서의 값. (C) 정제된 항체를 이용한 면역흡착반응검사. 동그라미: S1, 네모: S5, 세모: S16. 하얀 도형은 Negative control BSA가 코팅된 well에서의 값. 검은 도형은 GST에 융합된 N1 표면 항원이 코팅된 well에서의 값.


3. 연구의 성과 및 의의


현재까지 이용되어 온 항체 라이브러리 스크리닝 과정은 분류된 라이브러리 세포의 재생 단계 때문에 상대적으로 오랜 시간이 걸려서 전염성이 매우 강한 바이러스 질병에 대한 치료 혹은 진단 항체를 발굴하는 데에 불리함이 있었다. 그러나 본 연구진은 이번 연구 결과를 통해 분류된 라이브러리 세포의 재생 단계 없이 연속된 FACS 스크리닝을 통해 높은 활성의 항체 발굴이 가능함을 보였으며, 이를 통해 발굴된 항체가 실제 바이러스에 대해서도 제대로 역할을 하는 것까지 증명하였다. 본 연구를 통해서 구축된 초고속 항체 라이브러리 FACS 스크리닝 방법은 바이러스 질병 확산과 같이 시급히 항체가 필요한 시점에 굉장히 유용한 항체 개발 전략이 될 것으로 예상한다.

그림 3. 비활성된 실제 구제역 바이러스가 코팅된 kit를 이용한 면역흡착반응검사. 동그라미: SV7 (구제역 바이러스 항원에 대해서 스크리닝하여 발굴한 항체), 세모: Negative control 항체.


참고문헌
1. 항체의약품 개발 현황 보고서. 2013 한국 바이오 경제 연구센터.
2. Beck A, Wurch T, Bailly C, Corvaia N. 2010. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol 10:345-352.
3. Boder ET, Wittrup KD (1997) Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat Biotechnol 15:553-557.
4. Fushs P, Breitling F, Dübel S, Seehaus T, Little M. 1991. Targeting recombinanat antibodies to the surface of E. coli: Fusion to a peptidoglycan associated lipoprotein. Biotechnology 9:1369-1372.
5. Yim SS, Bang HB, Kim YH, Lee YJ, Jeong GM, Jeong KJ. 2014. Rapid isolation of antibody from a synthetic human antibody library by repeated fluorescence-activated cell sorting (FACS). PLOS One [Accepted].
6. Hoogenboom HR. 2005. Selecting and screening recombinant antibody libraries. Nat Biotechnol 23:1105-1116.




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