슈퍼 리파아제 : 다양한 기능의 펩타이드와 효소를 융합해 효소활성 극대화 기술 개발

한국과학기술원 김선창 교수

Recombinant Lipase Engineered with Amphipathic and Coiled-Coil Peptides / ACS Catalysis. 2015 July;5(9):5016-25

1. 연구배경

리파아제는 아밀라제(amylase) 및 프로테아제(protease)와 함께 3대 소화효소의 주축을 이루며, 생체 내에서 지방대사의 중요한 역할을 할 뿐 아니라, 식품산업, 제지산업, 및 제약산업에서 고가의 순수 광학이성질체 합성 그리고 에너지산업 분야에서 바이오디젤의 생산에 활용될 수 있는 등 폭넓은 활용범위를 갖고 있다. 전세계 리파아제 시장 규모는 2012년 약 2,600억원에서 2017년 3,500억원으로 증가할 것으로 예상되며, 관련 제품 시장규모는 수 십 조원에 이른다. 리파아제의 효소활성과 안정성을 증가시키기 위해 다양한 리파아제의 X-ray 구조를 분석하고, 효소 작용부위와 그 주변의 아미노산 치환하여 효소활성, 기질 특이성, 내열성, 프로테아제 안정성을 증가시키는 연구, 특히 위치지정 돌연변이 방법(site-directed  mutagenesis)과 같은 단백질 공학을 사용하여 리파아제를 개량하려는 연구가 많이 진행되어 왔으나, 리파아제의 활성이 부분적으로 증가되는 결과만을 얻을 수 있었다.

본 연구에서는 리파아제의 기질이 불용성이기 때문에 기질에 대한 접근성이 낮다는 점에 착안하여, 기존의 리파아제의 기질 접근성을 높이기 위해 친수기와 소수기를 모두 가지는 양친매성 (amphipathicity)의 펩타이드 및 리파아제를 다중합체로 형성케 하는 다중합 펩타이드 (coiled-coil peptide)를 융합시켜 기질에 대한 접근성, 결합성 및 반응성을 극대화시키는 슈퍼 리파아제를 개발하고자 하였다.

2. 연구결과

기존 리파아제의 다양한 구조 분석을 거쳐 리파아제 N-말단에 양친매성 펩타이드 (amphipathic peptide) BR2, BR3, NKC를 각각 결합시켰으며, 이를 4중합체로 형성케하는 다중합 펩타이드 (coiled-coil  peptide) MAT을 C-말단에 결합시켜 소수성 기질에 대한 접근성을 극대화하는 슈퍼 리파아제를 제작 하였다(그림 1). 

그림 1. 양친매성 및 다중합 펩타이드를 통한 슈퍼리파아제 구축 모식도.

리파아제에 양친매성 펩타이드를 결합시키고 이를 다중합 펩타이드를 통해 결함시킴으로써 슈퍼 리파아제를 구축.

야생형 M37, NKC-M37, NKC-M37-MAT 리파아제들의 지질 입자에 대한 위치 정도(localization)를 형광현미경으로 비교 분석한 결과, 야생형 M37 리파아제의 경우 지질 입자에 일부 위치하고 대부분이 반응액에 고루 분포되어 있는 반면, NKC-M37 리파아제는 리파아제 대부분이 오일 입자 주변에 위치하고 있음을 확인 할 수 있었으며, 이 정도는 다중합체인 NKC-M37-MAT 리파아제의 경우에서 더 극명함을 알 수 있었다(그림 2c). 이를 통해 양친매성 펩타이드는 친수성인 리파아제를 지질-물 계면 (lipid-water interface)로 빠르게 이동시킴으로써 지질 주변으로의 리파아제의 농도를 증가시키고 이로 인해 결합성 및 전체 기질-효소반응 속도를 극대화 시키며, 아울러 다중합 펩타이드는 리파아제를 다중합체로 결합함으로써 리파아제가 기질에 대해서 협력적 반응 (cooperatively interaction)을 나타내게 하였으며, 양친매성 펩타이드와 상조적으로 기질에 대한 접근성을 극대화 시킴을 알 수 있었다.

그림 2. 양친매성 펩타이드와 다중합 펩타이드의 리파아제 효소 활성에 미치는 영향 (a, b) 및

 형광현미경 분석을 통한 지질입자에 대한 리파아제 분포도 (c).

양친매성 펩타이드 및 다중합체 펩타이드를 통해 개량된 효소들의 효소활성(Catalytic activity, U/mg)을 p-nitrophenyl laurate(pNPL)기질을 사용하여 야생형 리파아제와 비교 분석한 결과, 양친매성 펩타이드가 결합된 리파아제의 활성이 현저히 증가함을 확인할 수 있었으며, NKC-M37 리파아제의 경우 약 1300 U/mg으로 야생형 M37 리파아제(64 U/mg) 대비 최대 20배까지 증가함을 알 수 있었다(그림 2a). 또한 다중합체 펩타이드가 결합된 NKC-M37-MAT 리파아제의 경우 NKC-M37 리파아제 대비 약 3배 가량 증가하며 최종적으로 야생형 M37 리파아제 대비 약 54배 가량 증가함을 확인 할 수 있었다(그림 2b). 아울러 이들 개량된 효소들의 효소-기질 반응속도(Kinetics)를 구한 결과, NKC-M37 리파아제의 경우 야생형 M37 리파아제 대비 기질 접근성(Km)이 약 7배 가량 증가함을 알 수 있었으며, Kcat의 경우 약 3배 가량 증가하여 최종적으로 효소 반응 속도(Kcat/Km)가 야생형 대비 약 19배 가량 증가함을 알 수 있었다. 또한 NKC-M37-MAT 리파아제의 경우 NKC-M37 리파아제에 비해 추가적으로 기질 접근성(Km)이 2배 가량 높아져 효소 반응 속도(Kcat/Km)가 야생형 대비 약 40배 가량 향상되는 결과를 얻을 수 있었다(표 1).

표 1. 양친매성/다중합체 펩타이드를 통한 개량효소들의 효소-기질 반응속도

최종적으로, 이 슈퍼 리파아제를 이용하여 바이오에너지 및 친환경 바이오화학물의 생산성 향상을 확인 하였다(그림 3a, b). 그 결과, 야생형 M37 리파아제의 경우 반응 시작 후 약 30시간 후에 올리브 오일을 바이오 디젤로 95% 이상 전환시키는데 반해 NKC-M37 리파아제의 경우 약 10시간 만에 95%이상 전환 시킴을 확인 할 수 있었다. 아울러 슈퍼 리파아제인 NKC-M37-MAT 리파아제의 경우 단 6시간 만에 같은 수율의 바이오 디젤을 생산 하여 전체 반응 생산시간의 80%를 단축시킴을 확인하였다(그림 3b).

그림 3. 효소촉매를 이용한 바이오디젤 생산 모식도 (a) 및

슈퍼 리파아제를 이용한 바이오 디젤 생산 시 시간 단축 확인 (b).

3. 연구의 성과 및 의의

본 연구진이 개발한 기술은 기존의 효소촉매를 이용한 전환반응이 가진 근본적인 문제를 극복할 수 있는 새로운 기술로써, 양친매성 펩타이드와 다중합체 펩타이드를 이용하여 리파아제의 소수성 기질에 대한 접근성을 극대화하여 효소활성을 증가시킴으로써 기존의 화학촉매(chemical catalysts)를 대체하여 친환경적이고 효율적인 산업적 유용 바이오화합물 생산의 토대를 마련하다. 현재 추가적인 산업화 연구가 진행중이며, 이를 산업화 할 때, 현재 약 3200억원의 리파아제 세계시장과 수십조에 이르는 관련시장에 지대한 파장을 끼칠 수 있으며, 궁극적으로는 효율적이고 친환경적인 바이오에너지 및 바이오 화학제품을 생산할 수 있는 스마트 바이오산업 개척이 가능할 것이다.

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