대장균 방향족 아미노산 생합성 경로의 대사공학적 개량과

이종 효소 발현을 통한 생물학적 페놀 생산

한국과학기술원 이상엽 교수

Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of phenol from glucose: Published online in Biotechnology Journal, Oct., 11, 2013

1. 연구배경

페놀은 페놀수지, 폴리카보네이트, 에폭시, 제초제 등의 생산에 있어 원료 물질로서 사용되며 이외에도 다양한 산업에서 폭넓게 사용되는 화학물질로서 현재 화석물질로 부터 석유화학공정을 통해 생산되고 있으며 2008년 기준으로 연 생산량 800만톤을 초과하였으며 향후 지속적인 수요증가가 예상되고 있다 (1,2). 최근 대기 중 이산화탄소의 증가와 그에 따른 환경오염, 화석연료자원의 공급 불안과 고갈문제가 세계적인 이슈가 되고 있으며 보다 친환경적이면서도 탄소순환형 기술을 이용한 다양한 화학물질을 생산을 통하여 석유자원에 대한 의존도를 줄이고 향우 이의 고갈에 대처할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 대사공학은 세포의 유전자를 조작하여 원하는 화합물을 대량으로 생산하도록 하는 기술로서 원하는 화합물의 대량생산은 대사공학분야의 가장 기본적이고 핵심적인 분야로서, 효소 등의 도입을 통한 새로운 화합물의 생산 및 기존 화합물의 생산량 증대를 목적으로 하며, 최근 석유 고갈 및 환경오염의 해결책으로 크게 각광 받고 있는 학문이다.

기존에 미생물을 이용한 페놀의 생산은 페놀이 가진 미생물에 대한 독성으로 인해 많이 연구되어 있지 못하고 있는 실정이며 슈도모나스 퓨티다 (Pseudomonas putida) 균주를 이용하여 1건의 보고가 되어 있으나 그 생산량이 리터당 1 g 미만이며 균주의 개량과 독성 문제 해결의 어려움으로 인해 더 이상의 향상이 이루어지지 못하고 있는 실정이다 (3). 대장균의 경우 대사공학적 연구가 가장 활발하나 방향족 화합물에 대하여 낮은 저항성을 지니고 있다고 알려져 있어 페놀 생산에는 적합하지 않은 미생물로 여겨지고 있다.

2. 연구결과

최근 다양한 대장균들의 유전적, 생리·대사적 차이점이 보고되고 있는데 이상엽 특훈 교수 연구팀은 이에 주목하여 다양한 대장균 균주가 페놀에 대해 다른 저항성과 페놀 생산을 위한 대사 특성을 지닐 수 있다는 가정 하에 최근 동 연구팀 내에서 개발한 합성 조절 sRNA 기반 유전자 조작기술을 통하여 18 종의 다양한 대장균 균주에 대하여 동시에 페놀생산을 위한 대사공학적 균주개량을 수행하였다 (4).

연구팀이 적용한 기술 중 합성 조절 sRNA (synthetic small regulatory RNA) 기술은 기존의 유전자 결실 방법에 월등히 빠른 시간에 대사흐름의 조절을 가능하게 하는 기술로써 18 종의 다양한 대장균에 대한 대사공학을 동시에 진행하는데 중요한 역할을 하였다. 세포내 유전자 발현은 DNA에 기록된 정보가 mRNA로 전달되고, 이를 ribosome이 해독하여 단백질로 만드는 과정이다. 합성 조절 RNA는 mRNA에 상보적으로 결합함으로써 mRNA의 기능을 억제하는 동시에 단시간 내에 제거함으로써 유전자 발현을 중간에 차단하는 것이다. 기존 Antisense RNA와 달리 합성 조절 RNA는 길이가 100nt 정도로 짧으며, 세포내 RNA interference 기작을 이용함으로써 매우 높은 효율로 (>90%) 세포 발현을 억제 가능하며, 상보적 결합 강도를 디자인하여 발현 억제 정도를 조절 가능한 장점이 있다.

그림 1. 페놀 생산을 위한 대사회로.

페놀은 tyrosine phenol-lyase (TPL) 라는 효소를 이종 발현하여 합성되어질 수 있는데 이 효소는 대장균의 자연 대사산물인 타이로신을 페놀로 전환한다. 따라서 효율적으로 타이로신을 생산할 수 있는 대장균 균주의 개발이 선행되었으며 다양한 균주에서 관련 유전자를 증폭하고 sRNA를 통한 knock-down (그림 1에서 녹색과 적색으로 표시)을 통하여 유가식 발효에서 21.9 g/L 의 타이로신을 생산할 수 있는 균주를 개발하였다.

이와 더불어 높은 생산성을 지니는 균주의 개발을 위해서는 페놀에 대한 저항성, TPL 효소의 발현강도, 활성등이 종합적으로 고려되어져야 하는데 본 연구팀에서는 실험에 사용되어진 18개의 모든 대장균 균주에 대하여 이를 분석한 결과 같은 대장균 내에서도 그 방향족 생합성경로의 활성, 공학적 활용도, 페놀에 대한 저항성에 있어 큰 차이가 있음을 발견하였으며 최종적으로 BL21 이라는 균주를 선정할 수 있었다.

그림 2. 다양한 대장균 균주의 타이로신 생산능과 페놀 저항성

배양 플라스크 내에서 균주별 페놀의 생산능은 10 배이상 차이를 보였으며 BL21 균주를 포함하여 생산능이 우수한 몇 몇 균주는 400 mg/L 이상의 페놀을 생산할 수 있었다.  페놀에 대한 저항성을 나타내는 지표로 사용되어질 수 있는 MIC (minimal concentration for cell growth inhibition) 또한 같은 대장균 내에서 커다란 차이를 보임을 알 수 있었다 (4).

 
산업적 생산을 위해서는 플라스크 내에서가 아닌 발효기를 통한 고 생산 프로세스가 요구되어지는데 페놀의 생산에 있어 가장 큰 걸림돌이 페놀의 독성을 연구팀은 발효 공정에서 페놀의 대장균에 대한 독성을 최소화 할 수 있는 이상발효 공정(biphasic fermentation)을 이용하여 페놀의 생산량을 증가시킬 수 있었다. 일반적인 발효는 발효기내에 세포성장을 위한 배지만을 넣고 진행되는데 이상발효 (biphasic fermentation) 에서는 기본적으로 수용액인 배지 외에도 이와 섞이지 않은 유기용제가 발효기내에 추가로 존재한다. 이러한 이상발효를 하는 주요 목적은 세포에 의한 생성물이 세포에 독성을 지니는 경우 생성물이 추가된 유기용제로 확산되어 선택적인 용해가 일어나도록 유도하여 높은 생성물의 농도를 얻기 위하여 사용되어진다. 유가식 발효에서는 발효기 내에 존재하는 탄소원 (예, 포도당)이 세포에 의해 거의 모두 소모되어진 후 일정한 간격으로 탄소원을 추가적으로 발효기에 공급함으로써 발효기내의 세포가 지속적으로 성장, 발효를 진행할 수 있도록 한다. 본 연구진은 이러한 이상 발효를 대장균-페놀 시스템에 적용하기 위하여 페놀을 수상 (aqueous phase)에 대하여 선택적으로 용해시키며 또한 대장균에 대해 무시할 만한 독성을 지닌 tributyrin 이라는 유기 용제를 이용하여 페놀생산을 위한 이상 유가식 발효 시스템을 구축하였다 (5). 이렇게 개발된 대장균 균주는 기존 균주에 비하여 월등이 높은 생산량과 생산능을 보였으며 이상 유가식 발효(biphasic fed-batch fermentation)에서 리터당 3.8 g의 페놀을 24 시간 내에 생산할 수 있었다.

3. 연구의 성과 및 의의

본 기술은 최근 이슈가 되고 있는 재생성 원료로부터 친환경 바이오 공정을 통하여 여러 종류의 바이오 화합물을, 특히 미생물에 대해 독성을 지니는 화합물을 생산 할 수 있는 플랫폼 기술이 될 수 있다는 점에서 큰 의의가 있다고 할 수 있다. 또한 기존의 기술로는 실현이 어려운 다양한 균주에 대한 동시 다발적인 개량이 이루어질 수 있음을 보였고 또한 그에 따른 장점을 선명하게 보여주는 결과를 얻을 수 있었다. 또한 본 연구에서 개발되어진 이상 유가식 발효 시스템은 세포에 대하여 독성을 지니는 다양한 화합물의 생산에 적용되어질 수 있을 것이다.

참고문헌

1. Weber, M., Weber, M., Phenols. in: Pilato, L. (Ed.), Phenolic resins: A Century of Progress, Springer, 2010.
2. Schmidt, R. J., Industrial catalytic processes-phenol production. Appl. Catal. A: General 2005, 280, 89-103.
3. Wierckx, N. J. P., Ballerstedt, H., de Bont, J. A. M., Wery, J., Engineering of solvent-tolerant Pseudomonas putida S12 for bioproduction of phenol from glucose. Appl. Environ. Microb. 2005, 71, 8221-8227.
4. Na, D., Yoo, S. M., Chung, H., Park, H. et al., Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs. Nat. Biotechnol. 2013, 31, 170-174.
5. Anbarasan, P., Baer, Z. C., Sreekumar, S., Gross, E. et al., Integration of chemical catalysis with extractive fermentation to produce fuels. Nature 2012, 491, 235-239.