생체내 안정성과 세포 특이성이 증진된 항균펩타이드의 개발

경상대학교 조주현 교수

De novo generation of short antimicrobial peptides with enhanced stability and cell specificity/J Antimicrob Chemother. 2013 doi:10.1093/jac/dkt322

1. 연구배경

항생제의 오남용으로 인해 미국 질병통제센터 (CDC)가 AMR (antimicrobial resistance) 병원 항생제 보고서에서 밝힌 바와 같이 2007년 한해 동안 약 9만명이 메티실린내성 황색포도상구균 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 감염되어 그 중 2만여명이 사망하였으며, 2010년에는 국내에서도 슈퍼박테리아라 일컬어지는 NDM-1 유전자를 함유한 카바페넴내성 장내균 (Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae, CRE)이 발견되는 등 내성균에 의한 위험성이 증가하는 추세이다. 이러한 내성균 치료를 위한 비용도 점차 증가하여 EU에서는 매년 15억 유로, 미국에서는 매년 200억 달러가 내성균 치료에 소요되며, 이에 더하여 총 사회적 비용으로는 350억 달러가 소요되는 것으로 나타났다 (2011년, WHO 통계치). 따라서 기존의 항생제를 대체할 새로운 항생물질의 개발이 절실한 실정이며, 최근들어 항균펩타이드가 대안으로 주목되고 있다. 항균펩타이드는 자연면역체계 (innate defense system)의 일원으로 모든 생물체가 가지고 있는 10-50개의 아미노산으로 구성된 작은 크기의 펩타이드로서 생물체가 병원균에 감염되었을 때 1차 방어물질로 작용한다 (1-2). 항균펩타이드는 신속한 작용기전, 기존 항생제 내성균에 작용, 광범위한 항균스펙트럼, 항 내독성 등의 특징을 가지고 있어 항생제 대체 물질로써 개발이 적합하다. 하지만 대다수의 항균펩타이드들이 생리적 염농도에서 불활성화되며 혈청 및 소화관 내에 존재하거나 병원균이 분비하는 단백질 분해효소에 의해 빠르게 분해되고 특정 수용체가 아닌 세포막에 직접적으로 작용하는 특성 때문에 미생물 뿐 아니라 인간세포에 대해서도 독성을 가지는 문제점이 있어 실제로 제품화된 것은 아직 없는 실정이다 (3-5). 기존의 연구들은 앞서 제기된 항균펩타이드의 실용화를 가로막는 문제점을 펩타이드에 일반적이지 않은 아미노산 잔기를 첨가하거나 구조에 이차 변형을 가한 유도체를 제작함으로써 해결하고자 하였으나 (6-7), 이 경우 펩타이드를 화학 합성을 통해서만 얻을 수 있고 생물학적 대량 생산이 불가능해지므로 생산 단가가 1g 당 100-600 달러에 달해 경제성이 낮아진다는 치명적인 단점이 있다 (8). 따라서 본 연구에서는 화학적 변형이 없는 일반적인 아미노산 잔기만을 이용하여 생리적 조건에서의 효능과 안정성, 인간 세포에 대한 무독성을 가지는 항균펩타이드를 개발하여 생물학적 발현 시스템을 이용한 대량 생산이 가능하도록 함으로써 실적용을 위한 경제성을 확보하고자 하였다.

2. 연구결과

데이터베이스 분석과 분자모델링 기법을 사용하여 일반적인 아미노산 잔기만으로 구성된 총 7개의 유도체 펩타이드 (GNU1~GNU7)를 디자인 하였다 (그림 1). 이들 중 GNU5 (RVVRPVVQVVKQKVR), GNU6 (RIIRPIIQIIKQKIR), GNU7 (RLLRPLLQLLKQKLR)이 다양한 미생물에 대해 강한 항균력을 나타내었는데, 특히 GNU6 (MICs 2-4mg/L)와 GNU7 (MICs 2-4mg/L)의 경우 기존에 알려진 강력한 항균펩타이드인 buforin IIb (MICs 0.5-4 mg/L)와 유사한 정도의 강한 항균력을 나타내는 동시에 생리적 조건 (150 mM NaCl, 10% serum)에서도 그 항균력이 유지되었다. 또한 기존 항균펩타이드들이 단백질 분해효소에 의해 수 분 내에 분해되어 항균력을 상실하는 것과는 달리, GNU6와 GNU7은 12시간까지 분해되지 않고 항균력을 유지하였으며 (그림 2), 환자로부터 직접 분리된 항생제 내성균인 MRSA와 vancomycin-resistant enterococci (VRE)에 대해서도 강력한 항균력을 가지는 것으로 확인 되었다 (표 1). GNU6와 GNU7은 인간 세포에 대한 독성을 나타내지 않았으며 (그림 3), 작용기작 분석 결과 세포막에 작용하여 permeabilization을 유발함으로써 항균력을 나타냄을 알 수 있었다 (그림 4).

그림 1. 유도체 펩타이드들의 Helical wheel diagram

그림 2. 유도체 펩타이드들의 단백질 분해효소에 대한 저항성 확인

A. 단백질 분해효소 처리에 의한 펩타이드의 분해여부를 tricine SDS-PAGE로 확인

B. 단백질 분해효소 처리 후 항균 활성 확인

표 1. 유도체 펩타이드들의 항생제 내성균주에 대한 항균활성 측정

그림 3. 유도체 펩타이드들의 인간세포에 대한 독성 확인

A. 유도체 펩타이드들의 용혈활성, B. 인간 세포주에 대한 세포독성 (MTT assay)

그림 4. 유도체 펩타이드들의 작용 기작 (SEM image)

3. 연구의 성과 및 의의

항균펩타이드는 기존의 항생제를 대체할 새로운 항생물질로 부각되고 있지만 낮은 생체내 안정성, 인간세포에 대한 독성, 높은 생산비용 등으로 인해 실용화에 이르지 못하고 있다. 기존의 연구들에서는 일반적이지 않은 아미노산 (D-form)이나 펩타이드 유사체 (peptidomimetics) 등을 이용해 유도체 펩타이드를 제작함으로써 이러한 문제점을 해결하려 했으나, 이 경우 펩타이드의 생산비용 높아져 경제성을 확보할 수 없는 문제가 있었다. 그러나 본 연구를 통해 개발된 GNU6와 GNU7 펩타이드는 일반적인 아미노산 잔기로만 구성되어 항생제 내성균에 대해 강한 항균력, 생리적 조건에서의 효능과 안정성, 인간 세포에 대한 무독성을 가지는 동시에, 생물학적 발현 시스템을 이용한 대량 생산이 가능하다. 따라서 항균펩타이드의 실용화에 가장 큰 걸림돌인 경제성을 확보할 수 있어 신규 항생제 내성균 치료제로의 개발이 가능할 것으로 기대된다.

참고문헌

1. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organism. Nature 2002;415:389-95
2. Fjell CD, Hiss JA, Hancock RE et al. Designing antimicrobial peptides: form follows function. Nat Rev Drug Discov 2011;11:37-51
3. Goldman MJ, Anderson GM, Stolzenberg ED et al. Human β-defensin-1 is a salt-sensitive antibiotic in lung that is inactivated in cystic fibrosis. Cell 1997; 88:553-60
4. Vlieghe P,  Lisowski V, Martinez J et al. Synthetic therapeutic peptides: science and market. Drug Discov Today 2010;15:40-56
5. Sieprawska-Lupa M, Mydel P, Krawczyk K et al. Degradation of human antimicrobial peptide LL-37 by Staphylococcus aureus-derived proteinases. Antimicrob Agents Chemother 2004;48:4673-9
6. Stromstedt AA, Pasupuleti M, Schmidtchen A et al. Evaluation of strategies for improving proteolytic resistance of atimicrobial peptides by using variants of EFK17, an internal segment of LL-37. Antimicrob Agents Chemother 2009;53:593-602
7. Giuliani A, Rinaldi AC. Beyond natural antimicrobial peptides: multimeric peptides and other peptidomimetic approaches. Cell Mol Life Sci 2011;68:2255-66
8. Yeung AT, Gellatly SL, Hancock REW. Multifunctional cationic host defense peptides and their clinical applications. Cell Mol Life Sci 2011;68:2161-76