Leucine Zipper를 이용한 세포 내 단백질 복합체 형성과 제어

한국생명공학연구원 이승구 박사, 김하성 박사

Controlled Localization of Functionally Active Proteins to Inclusion Bodies Using Leucine Zippers, PLOS ONE. June 04 2014, DOI: 10.1371/journal.pone.0097093.

1. 연구배경

Inclusion bodies (IBs)는 세포질에 소수성 단백질을 고발현할 때 흔히 발견되는 약 0.5~1.3 m 크기의 세포내 구조체이다 [1]. IBs는 일반적으로 세포내에서 단백질 고유의 활성을 나타내지 않는 것으로 알려져 있지만 최근 이러한 IBs들이 30~40% 정도의 단백질 활성을 유지한 채로 대장균 내에서 관찰된다는 연구가 보고되었다 [2, 3]. 본 연구는 이러한 활성형 IBs를 활용하여 세포 내 효소고정화 및 빠른 연속반응을 유도하려는 연구이다. 이를 위하여 leucine zipper(LZs)단백질을 친화성 태그(affinity tag)로 이용하여 목표 단백질이 IBs에 위치(localization)하는 정도를 실제 미생물 세포질 조건에서 조사하였다.

그림 1. (A) 상보적인 두 가닥의 LZ에 의한 상호작용, 점선은 glutamic acid와 lysin의 극성결합을 나타냄. (B) LZ를 이용해서 세포 내 RFP를 IBs로 국소화한 결과. (C) EGFP만 단독 발현시킨 경우(상단)와 EGFP-CBD을 대장균에서 발현시킨 후 활성형 응집체를 형성(하단)한 이미지

연구에서 사용된 LZs는 다양한 DNA 결합 단백질이나 dimerization 도메인에서 찾아볼 수 있는 heterodimer로서 한 가닥의 LZ에는 여러 개의 leucine 잔기가 7개 간격으로 위치하고 이는 소수성 alpha helix를 형성하여 이량체를 만들어낸다. 이러한 결합 특성을 이용하면 IBs에 수용성 세포질 단백질을 고정시키고 세포 내에서 해당 단백질을 국소화 시키는 효과를 얻을 수 있다(그림1A, 1B). 본 연구에서는 수용성 세포질 단백질의 예로 red fluorescent protein 1(mRFP1)을 사용 했으며 현미경과 flow cytometric 분석을 통하여 국소화된 mRFP1을 관찰하고 LZs의 결합 강도에 따라서 국소화 정도가 조절하고자 하였다.

2. 연구결과

세포 내에서 활성형 IBs의 형성을 확인하기 위해서 C. fimi 유래의 family II CBD의 C말단에 EGFP를 결합하여 대장균에서 발현 후 이미지로 관찰한 결과 세포 하나당 하나 또는 두 개의 IBs를 형성함을 보였다 [그림1C]. 본 연구팀은 위 CBD도메인이 다양한 효소를 활성형 단백질 입자로 전환시키는 효과가 있는 것을 이미 보고한 바 있다

LZs를 이용하여 IBs에 수용성 세포질 단백질을 고정하는 효과를 확인하기 위하여 mRFP1에 prey LZ를 연결하고 (prey-mRFP1) EGFP와 CBD를 결합한 EGFP-CBD 단백질에 bait LZ를 연결하여 (bait-EGFP-CBD) pET21a 백터에 구현 후 대장균에서 발현시켰다. 그 결과 bait-EGFP-CBD와 prey-mRFP1를 같이 발현시킨 세포에서는 국소화된 Red형광이 관찰 되었지만 bait LZ가 없이 발현시킨 세포에서는 형광이 세포 전체에 퍼져서 관찰되었다 [그림 3].

그림2.  bait-EGFP-CBD와 prey-mRFP1를 같이 발현시킬 경우 mRFP가 IBs로 국소화 되는 반면 (상단), 상호작용이 없는 경우 mRFP가 세포 내에 넓게 퍼져있음

이어서 LZ의 친화도에 따른 국소화를 관찰하기 위하여 다양한 KD 값을 가진 LZ를 준비하고 [4] (8, 20, 31, 50, 1000μM), prey-mRFP1의 국소화를 형광 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과 KD값이 8μM인 경우 국소화 되는 정도가 공유결합에 의하여 연결되는 EGFP-CBD를 발현시킨 결과와 비슷한 수준으로 관찰되었다. 이는 KD=8μM 이 세포 내에서 충분한 결합력을 제공하며 이보다 낮은 KD에서는 세포 내에서 국소화가 감소하는 것을 알 수 있었다 [그림4]. 이 결과는 다양한 세포 내 효소들을 필요에 따라 단백질입자로 이동시킬 수 있으며 결합정도 역이 LZ를 이용하여 컨트롤 할 수 있음을 보여주는 결과이다. 

그림 3. LZs의 결합 정도에 따른 단백질 (RFP)의 국소화 정도를 나타내는 현미경 이미지

한편 본 연구에서는 형광유세포분석기(FACS)를 단백질입자 형성 및 상호작용 관찰에 이용하는 방법을 구축하였다(그림4). 그 결과 LZ사이의 친화도에 따라서 국소화 정도가 달라지는 것을 FACS를 이용하여 고속 분석할 수 있었으며, 이는 살아있는 세포 내에서 상호작용을 직접적으로 분석하는 데 유용할 뿐만 아니라, 라이브러리 고속 검색을 통하여 상호작용 친화도를 개량하는 단백질공학 연구에도 유용한 기술임을 보여주는 것이다. 

그림 4. FACS를 이용하여 LZs의 결합정도에 따라 단백질의 IBs이동을 관찰한 결과

3. 연구의 성과 및 의의

합성생물학의 대표적 응용분야의 하나는 인공 단백질구조체를 이용한 고효율 합성이다 [5, 6]. 본 연구는 다양한 결합력을 갖는 LZs를 이용하여 세포질 내 다양한 대사체 합성효소를 고정화 하여 관련된 순차적 대사반응을 촉진하는 인공 구조체를 개발하는데 사용될 수 있을 것이다. 또한 본 기술은 단백질 간 상호작용을 고감도로 감지할 수 있어서 flow cytometry와 연계한 high throughput 단백질 상호작용 검출 플렛폼으로 사용될 수 있다.

참고문헌
1. Palmer I, Wingfield PT (2012) Preparation and extraction of insoluble (inclusion-body) proteins from Escherichia coli. Curr Protoc Protein Sci Chapter 6: Unit6 3.
2. Ventura S, Villaverde A (2006) Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol 24: 179-185.
3. Garcia-Fruitos E, Gonzalez-Montalban N, Morell M, Vera A, Ferraz RM, et al. (2005) Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins. Microb Cell Fact 4: 27.
4. Magliery TJ, Wilson CG, Pan W, Mishler D, Ghosh I, et al. (2005) Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: scope and mechanism. J Am Chem Soc 127: 146-157.
5. Dueber JE, Wu GC, Malmirchegini GR, Moon TS, Petzold CJ, et al. (2009) Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat Biotechnol 27: 753-759.
6. You C, Zhang YH (2013) Self-assembly of synthetic metabolons through synthetic protein scaffolds: one-step purification, co-immobilization, and substrate channeling. ACS Synth Biol 2: 102-110.