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       유전자 회로를 이용한 초고속 자원 탐색 시스템
               
       ISBC        2018.08.21 16:21        806
 

유전자 회로를 이용한 초고속 자원 탐색 시스템

한국생명공학연구원 바이오화학연구센터 이승구 박사


Toward a Generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits, ACS Synthetic Biology, 2014, dx.doi.org/10.1021/sb400112u


1. 연구배경


지구온난화나 화석기반 자원의 고갈은 인류가 직면한 가장 시급하면서도 풀기 어려운 문제 중 하나라고 할 수 있다. 현재 바이오나 태양광 등을 이용한 대체자원에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있는데 그 중 미생물과 효소촉매를 활용한 유용 화학물질 생산은 석유 유래 화학물질을 공해 없이 대체 생산할 수 있다는 장점 때문에 세계적으로 크게 주목을 받고 있다[1,2]. 상기의 석유화학산업 대체 생명공학 기술들은 “White biotechnology”로 분류되고 있고, 이러한 White biotechnology 기반 산업의 경제성을 높이기 위해서는 모든 생물공정을 구성하는 생화학 반응의 핵심 요소인 효소의 개량과 신규 효소의 발굴이 필수이며 본 연구진은 이러한 효소공학 핵심기술 중의 하나인 기능 기반 탐색작업을 초고속으로 수행할 수 있는 유전자회로기술을 개발하였다 (Genetic Enzyme Screening System, GESS). 특히 합성생물학적 개념을 도입하여 그 구성 부품들의 특징 파악과 함께 입력 및 형광을 이용한 출력을 정량적으로 정립함으로써 높은 확장성을 갖게 하였다. 또한 가장 풍부한 화학물질의 하나인 phenol류 물질의 감지를 기반으로 함으로써, GESS 단일 방법으로 다양한 효소를 검출 할 수 있는 범용성을 확보하였다. 실제로 이 시스템이 tyrosine phenol-lyase, β-glucosidase, lipase, cellulase, methyl parathion hydrolase (MPH) 등의 다양한 효소를 감지할 수 있음을 보였으며 메타지놈으로부터 신규 alkaline phosphatase를 검출하여 그 유용성을 증명하였다.


2. 연구결과


센서 회로 설계 및 정량화

이 시스템의 핵심은 dmpR 유전자가 phenol을 감지하여 하위 gfp 형광 유전자의 발현을 개시시키는 것이다. 즉 외부에서 phenol generating substrates를 입력으로 주었을 때 세포 내에 이 화합물을 분해하여 phenol을 만들어내는 효소(target)가 존재한다면 해당 세포가 형광을 보이는 원리를 이용하여 관심 효소의 활성 유무 및 수준을 판단하는 기술이다 (그림 1, 좌). 또한 센서 시스템 작동의 최적화와 정량화를 위해서 배양 조건 및 phenol의 농도에 따른 형광 발현의 정량화를 수행하였다 (그림 1 우).


그림 1. (좌) GESS 시스템의 핵심 메커니즘. 외부 Input 과 Target 효소가 존재할 때 Phenol을 만들어내는 AND 게이트 하나와 phenol과 dmpR이 존재할 때 EGFP를 발현시키는 또 다른 AND 게이트 두 개로 이루어져 있다. (우)


센서 작동 검증 및 응용

이렇게 구현된 센서의 실제 효소 공학적 응용을 위해서 정상적으로 관심 효소의 활성을 감지할 수 있는지 검증하였다. Tyrosine은 tyrosine phenol-lyase (TPL)에 의해서 ammonium과 pyruvate 그리고 phenol로 분해된다 (그림 2 상단). GESS는 이렇게 분해된 phenol을 감지하여 TPL 활성 효소를 가진 세포가 형광으로 명확히 분리 되는 것을 확인했다 (그림 2 하단).


그림 2. (상단) Tyrosine을 분해하여 phenol, pyruvate, ammonium으로 분해하는 TPL 효소. (하단) GESS 시스템으로 tpl 유전자를 보유한 세포와 그렇지 않은 세포를 명확히 분리 가능.


TPL외에 lipase, cellulase, MPH 등의 효소들에 대한 세포 내 활성도 검증하였으며 마지막으로 실제 유용한 신규 효소를 찾기 위하여 대규모 메타지놈 라이브러리를 제작하고 GESS시스템을 이용해 phosphatase의 활성을 갖는 세포를 검출하였다 (그림 3). 이렇게 검출 된 phosphatase의 단백질 서열을 분석하여 기존 알려진 alkaline phosphatase (AP from Sphingomonas sp.)와 약 59%의 상동성이 있음을 확인하고 이는 신규 phosphatase 효소임을 확인하였다. 


그림 3 GESS를 이용하여 메타지놈에서 신규 AP 효소를 검출하는 과정



3. 연구의 성과 및 의의


지난 10년간 합성생물학의 발달로 다양한 구조의 회로가 개발되어져 왔고 이제 산업적으로 가치 있는 응용 연구들이 진행되고 있다 [3-6]. 이에 본 연구실에서도 실용적인 유전자 회로인 GESS를 개발하여, 효소 공학에 필수적이지만 노동/시간 집약적인 우량효소 탐색 공정을 106cells/day 이상의 초고속으로 수행할 수 있는 혁신적인 기술을 개발했다는데 가장 큰 의의가 있다. 또한 정량적이면서도 단일 방법으로 다양한 효소를 검출 할 수 있어서 높은 범용성도 갖추고 있다. 이러한 유전자회로기술은 방대한 유전자원들로부터 신규 산업용 효소 및 대사경로를 발굴하거나 분자진화를 이용한 단백질 개량연구에 폭넓게 활용될 것이다. 또한 GESS의 구성 부품 및 입출력이 잘 정의되어 있으므로 이를 체계적으로 확장 및 응용하는 설계 시스템을 구축하면 궁극적으로는 예측 가능한 다기능 유전자 회로를 구현할 수 있게 되어 합성생물학을 기반으로 한 생물 산업의 발전에 크게 기여할 것이다. 끝으로 본 연구를 지원해 주신 글로벌프론티어 바이오합성사업단에 감사드리며 본 기술의 실용화 및 확장을 통하여 더욱 발전된 연구를 수행할 것을 약속드리는 바이다.


참고문헌

1. Wohlgemuth, R. (2010) Biocatalysiskey to sustainable industrial chemistry. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 713−724.
2. Lorenz, P., and Eck, J. (2005) Metagenomics and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 3, 510−516.
3. Steele, H. L., Jaeger, K.-E., Daniel, R., and Streit, W. R. (2008) Advances in recovery of novel biocatalysts from metagenomes. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 16, 25−37.
4. Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., and Watanabe, K. (2004) Substrate-induced gene expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23, 88−93.
5. Williamson, L. L., Borlee, B. R., Schloss, P. D., Guan, C., Allen, H. K., and Handels man, J. (2005) Intracellular screen to identify metagenomic clones that induce or inhibit a quorum-sensing biosensor. Appl. Environ. Microbiol. 71, 6335−6344.
6. Uchiyama, T., and Miyazaki, K. (2010) Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Appl. Environ. Microbiol. 76, 7029−7035.










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[1] [2]