합성 조절 RNA를 이용한 대장균의 대사 공학 연구

이상엽 특훈교수

Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic small regulatory RNAs / Nature Biotechnol., 2013 Jan 20;31(2):170-4.

1. 연구배경

최근 전 세계적으로 환경 문제 및 한정된 자원고갈에 대한 우려가 급증한 가운데, 이를 해결하기 위한 친환경적이고 재생산 가능한 생물체 기반의 생산 시스템 구축에 대한 관심이 증가하고 있다. 특히, 생물체 내의 대사회로를 조절하여 대사흐름을 목적 대사산물에 최적화하는 대사공학을 이용한 세포 공장 개발 기술은 다양한 바이오에너지, 화학제품, 의약품등을 효율적으로 생산하는데 널리 활용될 수 있어 전 세계적으로 연구가 활발히 진행되고 있다. 하지만 많은 관심과 투자에도 불구하고 기술의 가속화는 더딘 추세이다. 그 이유는 첫째, 생명체의 모든 대사회로를 살피고 분석하여 수많은 유전자 중 최종물질의 생산 효율을 높이기 위한 유전자 조작 표적 선정이 어렵다. 둘째, 선별된 조작 표적 유전자의 효과를 실험하는 과정에서 많이 시간과 비용이 소모되어 물리적 한계가 있다. 셋째, 기존 유전자 결실과 같은 방법은 유전자 기능을 온전히 손실시키기 때문에 유전자 발현을 원하는 수준으로 조절할 수 없고, 또한 세포의 염색체를 직접적으로 조작하므로 이를 다양한 균주에 적용할 수 없다 (1-4).

따라서, 종래의 기술의 한계점을 극복하기 위해, 본 연구진은 새로운 형태의 RNA를 이용하여 대상 균주의 염색체 서열을 전혀 변형하지 않으면서도 목적 유전자의 발현을 원하는 정도로 조절 및 감소시킬 수 있고, 동일한 유전자 발현 조절 기능을 다른 균주에도 쉽게 적용할 수 있는 빠르고 간편한 맞춤형 세포 설계 기술을 개발하는 연구를 시작하게 되었다. 본 연구는 연구실의 나도균박사와 유승민박사의 주도하에 정해나, 박혜권 석사과정생들이 참여하여 수행하였다.


2. 연구결과

이 연구는 앞서 언급된 대사 공학 분야가 직면한 기술적 한계를 새로운 합성 생물학 기술 개발을 통해 해결하였다. 본 연구는 대장균 세포 내 유전자 발현을 조절하는 조절 RNA의 기작에 착안하여 특정 유전자 발현을 원하는 정도로 조절이 가능한 합성 조절 RNA를 설계하는 기술을 개발하였다 (그림 1).

그림 1. (A) RNA 작용 메카니즘 모식도. (B) 합성 조절 RNA 구조

그림 2. 타이로신 최고 수율 생산 균주 선별

그림 3. TGA 회로에 적용된 sRNA 유전자 및 최고 cadavarine 생산 타겟 유전자 선별

합성 조절 RNA 기술을 활용하여 세포 대사의 중심 회로인 해당과정(glycolysis), TCA회로, 그 외 주변 다양한 회로에 존재하는 효소 및 이의 발현을 조절하는 전자 조절 인자(transcription factor)의 발현을 제어하는 합성 조절 RNA 라이브러리를 제작하였다. 그리고 이를 14 종의 다양한 대장균 균주에 도입함으로써 다양한 의약 화합물의 전구체로 사용되는 tyrosine (5-6) 을 보고된 최고 수율로 생산하는 균주(S17-1) 및 이의 타겟 유전자 (tyrR 및 csrA)를 발굴하여 세계 최고 수율 (21.9 g/L)을 생산하는 세포 공장을 개발하였다 (그림 2). 또한 동일 전략을 다양한 석유 화학 제품에 활용되는 cadaverine 생산에 도입함으로써 기존에 보고된 수율 (7) 보다 높은 수율 (12.6 g/L)의 대장균 세포 공장을 개발하는데 성공하였다 (그림 3).


3. 연구의 성과 및 의의

본 연구에서는 타겟 유전자의 서열을 변형하지 않으면서 특정 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 합성 조절 RNA를 개발하였다. 합성 조절 RNA는 표적 유전자의 mRNA와의 결합력을 조절함으로써 억제정도를 조절할 수 있는 장점이 있으며, 유전자 발현을 조절하는 합성 조절 RNA를 통해 기존의 유전자 결실을 통한 과정 없이 효과적으로 제작, 목적 유전자 발현을 감소시킬 수 있어 재조합 미생물 제조에 유용하며, 다양한 균주에서 빠르게 적용할 수 있어 최적 균주 선정에 매우 적합하다. 그 결과, 맞춤형으로 합성된 조절 RNA를 이용하여 지난 수 십 년간 기존의 대사공학으로 만들어진 어떠한 미생물보다 더 높은 생산성을 갖는 미생물 세포 공장 (타이로신 세포공장, 카다베린 세포공장)을 건설하는데 성공하였다. 이 연구에서 나온 결과는 세계 최초로 합성 조절 RNA 설계 기법을 이용하고 대사 공학에 적용함으로써 기존 대사 공학 기술을 향상시킨 것이다. 새롭게 개발된 RNA 기반의 대사회로 재설계 기술은 맞춤형 미생물 세포공장 건설을 위한 플랫폼이므로, 석유에너지를 대체할 바이오에너지에서부터 고가의 의약품, 친환경 소재등 기존의 세포공장에서 생산할 수 있는 모든 물질들을 보다 쉽고 빠르게 생산하는 것이 가능하므로 그 활용도는 산업적으로 의학적으로 무궁무진할 것이다.

참고문헌
1. Ho, C.H. et al. A molecular barcoded yeast ORF library enables mode-of-action analysis of bioactive compounds. Nat. Biotechnol. 27, 369–377 (2009).
2. Kress, W.J. & Erickson, D.L. DNA barcodes: genes, genomics, and bioinformatics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 2761–2762 (2008).
3. Saito, H. & Inoue, T. Synthetic biology with RNA motifs. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41, 398–404 (2009).
4. Desai, S.K. & Gallivan, J.P. Genetic screens and selections for small molecules based on a synthetic riboswitch that activates protein translation. J. Am. Chem. Soc. 126, 13247–13254 (2004).
5. Lüutke-Eversloh, T. & Stephanopoulos, G. l-tyrosine production by deregulated strains of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103–110 (2007).
6. Juminaga, D. et al. Modular engineering of l-tyrosine production in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 78, 89–98 (2012).
7. Qian, Z.-G., Xia, X.-X. & Lee, S.Y. Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: a five-carbon diamine. Biotechnol. Bioeng. 108, 93–103 (2011).