빛에 의한 Tetracycline 의 Tet Repressor 단백질에의 결합력 조절

서울대학교 이지연 교수

Light-Regulated Tetracycline Binding to the Tet Repressor, Chem. Eur. J. 2014, 20, 2508-2514

1. 연구배경

살아있는 세포는 외부환경의 변화에 적응하는 효과적인 방법을 가질 수 있도록 진화해왔다 (1). 단백질 내의 신호전달 경로를 이해하는 것은 합성생물학 혹은 bioengineering 분야에서 필수적이며 광학적인 방법을 통해 단백질의 기능을 재설계하는 것은 시간적 공간적 조절의 정확성을 가지고 생물학적 시스템을 조절 할 수 있기에 매우 중요하다고 할 수 있다. 그 중에서도 외부 환경의 변화에 따른 시그널을 인지하여 세포 내의 단백질이 적응할 수 있도록 하는 빛에 반응하는 단백질 (light sensing protein)은 합성생물학에서는 새로운 바이오부품으로서 주목받고 있다. Light-oxygen-voltage (LOV) 도메인은 신호전달에 관여하는 Per-Arnt-Sim (PAS) 라는 단백질의 한 그룹으로서 그중에서도 Avena sativa의 phototropin에 존재하는 As-LOV 도메인은 C-terminal에 존재하는 helix의 구조가 빛에 의해 가역적으로 변화하는 것으로 알려져 있고 이에 대한 많은 연구가 이미 보고되었다 (2). 한편 Bacillus subtilis에서 유래한 YtvA 단백질은 dimer로 구성되어 있으며(3) 빛에 의해 excited 된 상태가 다시 ground 상태로 전환되는 dark regeneration 되는 속도가 다른 light sensing 단백질들에 비해 현저하게 느리다고 알려져 있다 (4). 본 연구에서는 빛에 반응하는 이 두 가지 단백질을 DNA에 binding하는 Tetracycline repressor (TetR)(5)에 엔지니어링하여 새로운 스위치 단백질을 합성하고 그 기능을 분석하고자 하였다.

2. 연구결과

본 연구에서는 기능에 있어서 연관이 없는 두 종류의 단백질을 유전자 재조합 방식을 이용해 융합 단백질을 생성하여 빛에 의해 두 단백질이 상호작용하게 됨을 보여주었다. Electrophoretic mobility-shift assays (EMSA)와 Tetracycline의 형광 titration 실험 결과는 chromophore에 흡수된 빛이 TetR의 N-terminal쪽의 DNA에 결합하는 도메인을 거쳐 Tetracycline 에 결합할 수 있는 C-terminal 도메인으로 전달되어 Tetracycline binding에 영향을 주었음을 보여주었다. 흥미로운 사실은 빛이 스위치 단백질의 기능에 미치는 영향이 sensing 단백질에 따라 다르게 나온다는 사실로, YtvA-TetR 의 경우 빛이 존재할 때 tight하게 Tetracycline에 결합이 이루어 졌고, As-TetR의 경우 빛에 의해 Tetracycline 결합이 약해짐으로써 DNA binding 하는 정도가 달라짐을 관찰하였다. 이는 빛에 의한 스위치 단백질의 기능조절이 sensing 단백질이 가지는 고유의 메카니즘의 영향을 받는 다는 사실을 알려주고 있다.

그림 1. YtvA-LOV와 As-LOV 단백질의 구조와 LOV domain의 작용 기전

그림 2. Ytv-TetR과 As-TetR 단백질의 타겟 DNA 서열 (tetO)에의 binding 양상을 EMSA로 분석함. DNA에 결합된 단백질과 free DNA의 비율로부터 Ytv-TetR의 경우 빛의 상태에서 DNA 해리가 증가하고 As-TetR의 경우는 Dark 상태에서 DNA 해리가 증가함을 알 수 있음. 이는 sensing 모듈의 성질규명과 신호전달 최적화를 통해 스위치의 기능을 조절할 수 있음을 보여줌.

그림 3. YtvA-TetR 의 경우 빛이 존재할 때 tight하게 Tetracycline에 결합이 이루어 졌고, As-TetR의 경우 빛에 의해 결합이 약해지는 것을 형광 titration 실험을 통해 규명함. 이는 그림 2에서 Tetracycline에 의해 타겟 DNA가 해리되는 결과가 빛에 의해 조절되는 경향과 일치함을 보여주고 있음.

3. 연구의 성과 및 의의

본 연구를 통해 빛에 의한 신호의 전달이 기능적으로 연관성이 없는 LOV와 TetR 단백질 내에서 전달될 수 있게 함으로써 Flavin mononucleotide (FMN)이라는chromophore에서 받아들인 빛 신호가 TetR 단백질의 기능을 조절함을 보여주었고, TetR 단백질 내 도메인 간의 신호가 N to C 그리고 C to N 양쪽 방향으로 전달될 수 있음을 확인하였다. 또한 빛에 의해 항생제의 반응성을 조절한 최초의 연구로서 새로운 치료제 개발 전략에 응용될 수 있음을 보여주었다. 이는 합성생물학에서 필요로 하는 bio-part로서 사용할 수 있는 단백질로 light sensing 도메인과 DNA 결합 단백질 모듈을 응용할 수 있으며 그 특성을 규명함으로써 세포내 새로운 device를 개발하는데 활용할 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 과정들은 궁극적으로는 부품화된 단백질 간의 상호작용에 대한 이해를 바탕으로 하며 본 연구의 결과는 well-define된 분할 조립 가능한 바이오부품을 만드는데 공헌 할 수 있을 것으로 본다.

참고문헌

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