FPP synthase 융합단백질 구축을 통한 대장균에서의

Z,E-계열의 세스퀴-터페노이드 고생산 기술 개발

경상대학교 김선원 교수

EngineeredheterologousFPPsynthases-mediated Z,E-FPP synthesisin E. coli / Metabolic Engineering. 2013 July, 18:53-59.

1. 연구배경

이소프레노이드는 MEP 경로 또는 MVA 경로로부터 생성된 IPP 및 DMAPP로부터 합성된다(1, 2). 이소프레노이드의 신장은 IPP와 DMAPP의 head-to-tail 축합으로 시작되며 여기에 계속 IPP가 붙어나가면서 모노-터페노이드, 시스퀴-터페노이드, 다이-터페노이드 등이 생성된다(3). 이소프레노이드의 사슬 신장은 새로 형성된 이중결합에 대하여 두 가지 방식, E 및 Z로 진행될 수 있다. 따라서 입체특이적 반응 (stereospecific reaction)은 4 가지 구조의 E,E-, E,Z-, Z,E- and Z,Z-FPP를 생성한다(4). 상기의 입체화학반응에는 각각 E-FPP synthase 및 Z-FPP synthase가 관여한다. 대장균의 IspA을 포함한 대부분의 FPP synthase는 모두 E-이중결합 형성 효소로서, 1 DMAPP와 2 IPP의 E-축합을 촉매하여 E,E-FPP를 형성하다. E,E-FPP는 생명체에서 콜레스테롤, 파네실화 단백질, 유비퀴논 및 돌리콜과 같은 필수 세포성분의 생합성에 이용된다(5, 6, 7, 8). 세스퀴터페노이드는 FPP로부터 유래되는 천연화합물의 큰 패밀리이다. 지금까지 발견된 세스퀴터페노이드 생합성과 연관된 대부분의 FPP synthase는 E 타입이다. 따라서, E,E-FPP가 세스퀴터펜 신타제의 기질인 것으로 당연히 여겨졌으나, E,E-FPP가 실제로 가장 선호하는 기질인지는 입증되지 않았다(9). 사실, 면화 조효소 추출물은 E,E-입체이성질체의 촉매화에 비하여 더 높은 효율로 Z,E- 또는 Z,Z-FPP를 δ-카디넨으로 전환시킨다(10). 또한 토마토 유래의 세스퀴터펜인 endo-bergamotene의 고리화는 입체화학적 제한으로 인하여 E,E-FPP 보다는 Z,E-FPP를 더 선호하는 것으로 보고되었다(11). 상기한 사실들을 고려하면, 세스퀴터페노이드 생산을 위하여 Z-타입 FPP를 효율적으로 생산하는 효소를 만드는 것이 중요하다. 그러나 Z-FPP synthase는 현재까지 클로닝 된 보고가 없고, Mycobacterium tuberculosis의 Z,E-FPP synthase (Rv1086)가 GPP와 IPP의 Z-축합을 촉매하는 효소로 유일하게 보고되었다(12). 몬 연구에서는 대장균의 IspA와 Rv1086을 융합해서 IPP와 DMAPP로부터 Z,E-FPP를 만드는 신규 융합효소를 제작하고 대장균에 도입해서 Z,E-세스퀴터펜 알코올인 Z,E-farnesol (FOH) 고생산에 성공하였다(그림 1).

그림 1. DMAPP와 IPP로부터 E,E- 또는 Z,E-FPP의 합성 및 세스퀴터펜 알코올인 farnesol 생합성 경로도

2. 연구결과

IPP/DMAPP 생합성 경로가 강화된 재조합 대장균 SN에 IspA만을 증폭한 균주 SN-I는 E,E-FOH만을 만들고, Rv1086만을 증폭한 균주 SN-Rv는 E,E-FOH와 Z,E-FOH를 동시에 만들지만 IspA의 부족으로 총 FOH 생산량이 감소하고, IspA와 Rv1086을 같이 증폭한 균주 SN-IRv는 총 FOH 생산량의 감소 없이 E,E-FOH와 Z,E-FOH를 만들지만 Rv1086의 GPP 기질 접근성이 떨어지기 때문에 Z,E-FOH의 비율이 크게 감소하고, IspA와 Rv1086을 융합한 효소 ILRv를 증폭한 경우에는 총 FOH 생산량 및 Z,E-FOH의 비율도 크게 증가를 하였다(그림 2). 이것은 IspA와 Rv1086이 분리되어 있는 경우에 IspA가 만드는 공통 중간기질인 GPP에 대한 접근성이 Rv1086이 IspA에 비해서 현저히 떨어지지만 융합단백질인 ILRv의 경우에는 거리에 대한 불리함이 없이 공정한 GPP 기질경쟁에서 Rv1086이 IspA 비해서 우선적으로 GPP를 이용한다는 것이다. GPP 까지만 만드는 IspA 돌연변이 효소인 IspAS80F가 융합된 효소인 IS80FLRv를 증폭한 경우에는 Z,E-FOH의 비율 증가 없이 총 FOH 생산량만이 감소를 했는데 이것은 돌연변이 효소인 IspAS80F의 GPP 생합성 효율이 감소했기 때문으로 추정된다. Rv1086 효소의 활성핵심 부위의 돌연변이로 불화성화 된 Rv1086V107G이 융합된 효소인 ILRvV107G를 증폭한 경우에는 Z,E-FOHrk 생성되지 않았고 총 FOH 생산량은 변화가 없었다.

그림 2. M. tuberculosis의 Rv1086를 발현하는 재조합 대장균에서의 Z,E-FOH 생산성 변화 분석 (A) 재조합 대장균에서 추출된 FOH의 GC 크로마토그램. 피크 1과 2는 각각 Z,E-FOH와 E,E-FOH를 나타냄. (B) 재조합 대장균 배양에서 얻어지는 총 FOH 생산량(검정 막대)과 Z,E-FOH 생산비율(흰색 막대).

3. 연구의 성과 및 의의

본 연구는 GPP를 기질로 하는 Z,E-FPP synthase인 M. tuberculosis의 Rv1086과 대장균의 E,E-FPP synthase (IspA)를 융합해서 IPP/DMAPP로부터 Z,E-FPP를 합성할 수 있는 신규 Z,E-FPP synthase 융합효소 구축에 관한 것이다(그림 3). 자연계에는 Rv1086과 같이 사용할 수 있는 효율적인 GPP synthase가 없다. 대장균의 IspA를 GPP synthase로 돌연변이 시킨 경우에도 돌연변이 효소인 IspAS80F의 GPP 생합성 효율이 크게 감소해서 좋은 대안이 될 수가 없었다. 그러나 본 연구에서는 IspA와 Rv1086의 효과적인 융합만으로도 우수한 성능의 신규 Z,E-FPP synthase 효소를 제작할 수 있었다. 이것은 IspA로부터 만들어지는 GPP 이용에 대한 Rv1086의 거리의 불리함을 융합을 통해서 제거했기 때문이다. Z,E-FPP는 대장균에서 비대사성 대사산물(non-metabolizable metabolite)이기 때문에 세포내에서 합성된 Z,E-FPP는 모두 목적하는 세스퀴테펜 생합성에 사용될 수 있어서 Z,E-FPP synthase 융합효소가 도입된 재조합 대장균에서는 세스퀴터페노이드의 고생산을 기대할 수 있다.

그림 3. 대장균의 IspA와 M. tuberculosis의 Rv1086의 세포내에서의 공간적 위치와 그에  따른 생산물의 변화에 대한 모식도

참고문헌

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2. Rohdich, F., Hecht, S., Gartner, K., Adam, P., Krieger, C., Amslinger, S., Arigoni, D., Bacher, A., Eisenreich, W., 2002. Studies on the nonmevalonate terpene biosynthetic pathway: metabolic role of IspH (LytB) protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1158-63.
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4. Thulasiram, H. V., Erickson, H. K., Poulter, C. D., 2007. Chimeras of two isoprenoid synthases catalyze all four coupling reactions in isoprenoid biosynthesis. Science. 316, 73-6.
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12. Schulbach, M. C., Brennan, P. J., Crick, D. C., 2000. Identification of a short (C15) chain Z-isoprenyl diphosphate synthase and a homologous long (C50) chain isoprenyl diphosphate synthase in Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem. 275, 22876-81.